Синоназальные папилломы — группа доброкачественных, относительно редко встречающихся опухолей синоназального тракта с различным клиническим течением. В современной классификации ВОЗ принято выделять 3 подтипа синоназальных папиллом: наиболее часто встречающийся инвертированный тип (ИСП), онкоцитарный (ОСП) и экзофитный (ЭСП). Первые два являются клинически более агрессивными, с наличием местно-деструирующего роста, частыми рецидивами и определенной способностью к малигнизации. ЭСП, как правило, не рецидивирует, имеет экзофитный характер роста, случаи малигнизации описаны не были. Несмотря на это, все 3 подтипа синоназальной опухоли относятся к группе синоназальных папиллом [1, 2].

В последнее время появилась концепция, в связи с которой различные типы синоназальных папиллом — это не варианты одной опухоли, а скорее, отдельные опухоли. Так, ОСП показывает KRAS-мутации, патогенез ИСП связан с EGFR-мутациями, а ЭСП тесно ассоциирована с инфекцией, вызванной вирусом папилломы человека (ВПЧ) низкого риска злокачественности [3, 4].

Так как синоназальные папилломы относятся к эпителиальным неоплазиям, большой интерес представляет изучение регуляции клеточной пролиферации и дифференцировки формирующего их эпителия. Как и в любой другой эпителиальной опухоли, в синоназальных папилломах происходят ослабление центральной регуляции процессов пролиферации и дифференцировки и переход преимущественно к ауто/паракринным механизмам — важнейшим путям автономизации жизнедеятельности опухолевой клетки. К числу местных (ауто/паракринных) регуляторов пролиферации опухолевых клеток относятся так называемые факторы роста — полипептиды, продуцируемые опухолевой клеткой или окружающей ее стромой и взаимодействующие с соответствующим рецептором на мембране самой клетки-продуцента либо на мембране соседней клетки, в частности рецептор эпидермального фактора роста (EGFR).

EGFR относится к протеинкиназным ферментам и участвует в регуляции транскрипции, дифференцировки клеток, клеточного цикла, цитоскелетной организации, апоптоза. Эпидермальный фактор роста (ЭФР) — низкомолекулярный полипептид с молекулярной массой 6,4 кДа — является мощным митогеном для клеток эктодермального, мезодермального и эндодермального происхождения. ЭФР взаимодействует с рецепторами эпидермального фактора роста (EGFR) на мембранах клеток. EGFR — крупный трансмембранный гликопротеид с молекулярной массой 170 кДа. Ген EGFR человека расположен на хромосоме 7p12.1—12.3. В состав ЭФР-рецепторного семейства входят 4 белка: EGFR; HER2 (ErbB2, Neu); HER3 (ErbB3); HER4 (ErbB4).

В исследованиях последнего времени, используя секвенирование нового поколения и секвенирование по Сэнгеру, были показаны активирующие мутации EGFR у 88% пациентов с ИСП и 77% — с плоскоклеточным раком, ассоциированным с ИСП. Так, было показано, что мутация гена EGFR в 20-м экзоне часто встречается в ИСП и плоскоклеточных раках, ассоциированных с инвертированными папилломами синоназального тракта [5]. При этом следует отметить, что мутации EGFR не были идентифицированы в экзофитных или онкоцитарных папилломах или плоскоклеточных раках синоназального тракта, не связанных с ИСП, что позволяет предположить, что спектр ИСП и плоскоклеточный рак, не ассоциированный с ИСП, биологически различен среди плоскоклеточных опухолей носа и придаточных пазух [3]. Большинство мутаций EGFR представляло собой вставки (инсерции) в 20-м экзоне, а остальные — состояли из делеций и однонуклеотидных замен в 19-м и 20-м экзонах [6, 7].

Следует отметить, что в последнее время появился ряд работ, показывающих взаимоисключающую роль ВПЧ-инфекции и мутации EGFR. Так, ИСП и плоскоклеточный рак, ассоциированный с ИСП, демонстрировали либо мутацию EGFR, либо инфекцию ВПЧ. ВПЧ и мутация EGFR были взаимоисключающими во всех случаях плоскоклеточного рака, связанного с ИСП, и во всех случаях ИСП. Подтипы ВПЧ при ИСП и плоскоклеточном раке, ассоциированном с ИСП, были преимущественно низкого риска. При этом прогрессирование ИСП до плоскоклеточного рака было значимо связано с наличием инфекции ВПЧ и отсутствием мутации EGFR [8].

Цель исследования — дать сравнительную характеристику последовательностей 20-го экзона гена EGFR по результатам секвенирования по Сэнгеру в синоназальных папилломах инвертированного и онкоцитарного типов.

Материал и методы

Секвенирование было выполнено в 83 случаях синоназальных папиллом, из них 17 образцов представляли ОСП и 66 — ИСП. ДНК выделяли из архивных образцов операционного материала, фиксированного в парафине. Выделение ДНК проводили с использованием набора Экстракт ДНК FFPE (ООО «Номотек», Москва), согласно инструкции производителя. Концентрацию выделенной ДНК определяли методом количественной ПЦР в реальном времени с использованием тест-системы для выявления гена сурвивина человека для научного применения (ООО «Нанодиагностика», Москва). Амплификацию участка, содержащего 20-й экзон гена EGFR, проводили с помощью праймеров EGRFex20F 5’-GTTGTAAAACGACGGCCAG TGCATGCGAAGCCACACTGA-3’ и EGRFex20R 5’-AG GATCCTGGCTCCTTATCT-3’. Очистку ПЦР-продуктов проводили переосаждением в этаноле, секвенирование по Сэнгеру — в компании «Евроген» (Москва). Полученные сиквенсы «обрезали» по границам 20-го экзона гена EGFR и выравнивали с использованием программы MEGA v. 11.0.13. В качестве референса EGFR использовали последовательность NC000007.14.

Дополнительно с некоторых блоков, используемых ранее для секвенирования по Сэнгеру, было проведено иммуногистохимическое исследование. Данная часть исследования выполнена на операционном и биопсийном материале в объеме 10 наблюдений ИСП и 10 — ОСП. Материал фиксировали в 10% забуференном формалине в течение 24 ч с последующим изготовлением парафиновых блоков и обзорных препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином по стандартному протоколу. Для иммуногистохимического исследования получали срезы толщиной 4 мкм, которые наносили на высокоадгезивные стекла (X-tra Adhesiva, «Leica Biosystem») и высушивали при температуре 37 °C в течение 12 ч. Восстановление антигенной активности проводили в буфере Epitope Retrival Solution; pH 9,0 («Leica Biosystem») при температуре 120 °C в течение 20 мин и последующем остывании — 90 мин. В качестве первичных антител использовали моноклональные кроличьи антитела к EGFR (клон: EP11) фирмы «EPITOMICS» в разведении 1:200. В качестве детекционной системы применяли Novolink Polymer Detection System («Leica Biosystem»), в качестве хромогена — диаминобензидин. Иммуногистохимическую реакцию с использованием антител к EGFR оценивали полуколичественным методом, где иммунопозитивная реакция в эпителиальном пласте опухоли: отсутствовала (0 баллов), присутствовала менее чем в 50% эпителиального компонента (1 балл) и более 50% эпителиального компонента (2 балла), давала иммунопозитивную реакцию в 100% эпителиального пласта (3 балла).

Статистический анализ проводили в программном обеспечении Jamovi version 2.5.3. Для оценки статистической значимости различий двух и более показателей применяли метод непараметрического анализа — критерий χ² Пирсона. Уровень значимости взаимосвязи был достоверным при p<0,05.

Результаты

При иммуногистохимическом исследовании с антителами EGFR отмечалась вариабельная реакция в каждом случае, а также в различных полях зрения в пределах одного случая. Вариабельность иммуногистохимической реакции выражалась в чередовании участков с иммунопозитивной и иммунонегативной цитоплазматической и мембранной реакцией в разном соотношении.

В группе ИСП в 7 случаях из 10 отмечалась иммунопозитивная мембранная и цитоплазматическая реакция более чем в 50% эпителиального компонента (2 балла), экспрессия носила очаговый характер. Лишь в 3 случаях была выявлена иммунопозитивная реакция в 100% эпителиального компонента (3 балла). В 8 случаях ОСП из 10 была выявлена иммунопозитивная мембранная и цитоплазматическая экспрессия <50% эпителиального компонента (1 балл) и лишь в 2 случаях — >50% (2 балла). Таким образом, была показана иммуногистохимическая гетерогенность экспрессии EGFR в эпителиальном компоненте синоназальных папиллом в пределах одного клинического случая как инвертированного, так и онкоцитарного типа (см. рисунок).

Экспрессия EGFR в эпителиальном пласте синоназальных папиллом.

а — экспрессия EGFR менее чем в 50% эпителиального компонента в ОСП; б — экспрессия EGFR более чем в 50% эпителиального компонента в ОСП; в — экспрессия EGFR более чем в 50% эпителиального компонента в ИСП; г — экспрессия EGFR в 100% эпителиального компонента в ИСП.

Иммуногистохимическая реакция, ×100.

При секвенировании по Сэнгеру были получены следующие данные. Экстракция ДНК и секвенирование по Сэнгеру EGFR 20-го экзона были успешными в 66 (93%) из 71 случая ИСП и в 17 (100%) из 17 случаев ОСП. Пять случаев ИСП имели слишком гетерогенную последовательность нуклеотидов и не вписывались в общие рамки считывания всей группы EGFR более чем на 80%, ввиду этого такие случаи были восприняты как техническая погрешность и исключены из исследования.

Из 66 случаев ИСП у 48 (63%) пациентов были выявлены различные мутации, в то время как лишь в 18 (37%) — мутации не обнаружены вообще. При этом у 40 пациентов были показаны только единичные замены или делеции нуклеотидов, характеризующиеся генетической гетерогенностью, а у 8 — множественные замены или делеции более чем в 5 позициях. Из этих 8 пациентов у 4 наблюдались одинаковые мутационные паттерны во всех проанализированных образцах. Обзор мутаций гена EGFR, встретившихся с частотой >1% (n=33) в ИСП и ОСП, приведен в таблице.

Мутации в 20-м экзоне гена EGFR, встречающиеся с частотой >1% в синоназальных папилломах инвертированного и онкоцитарного типов

Примечание. Замена: * — аспарагина (N) на гистидин (H); ** — глутамина (Q) на гистидин (H); *** — глутамина (Q) на гистидин (H); **** — глутамина (Q) на гистидин (H).

В группе ИСП были обнаружены мутации в позиции 2622: в 47 (71%) образцах наблюдалась синонимичная транзиция G на A, которая не влияла на аминокислотную последовательность конечного белка; в 4 (6%) — в этой позиции выявлялась делеция гуанинового остатка, значение которой трудно оценить, так как наряду с этой делецией в сиквенсах наблюдались и другие точковые делеции.

Помимо мутаций в позиции 2622, были обнаружены и другие мутации: трансверсия A → C в позиции 2683, что ведет к замене аспарагина (N) на гистидин (H); трансверсии G → T (7 случаев) и G → C (2 случая) в позиции 2697, что ведет к замене глутамина (Q) на гистидин (H); делеция A в позиции 2684, которая в этих случаях была не единственной в сиквенсе, что затрудняет интерпретацию ее значения.

Последовательности 20-го экзона в группе ОСП (n=17) характеризовались в сравнении с группой ИСП относительной однородностью, отсутствием единичных нуклеотидных замен и делеций. Так, лишь в позиции 2548 была выявлена транзиция G на A в 1 случае; а также в позиции 2262 — транзиция G на A в 12 (70%) случаях. При этом обе эти замены были синонимичными и не приводили к замене кодируемой аминокислоты.

Наиболее значимым событием в экзоне 20-го гена EGFR в рамках нашего исследования являлась транзиция G на A в позиции 2262, что составило 70% в группе ОСП и 71% — ИСП. Таким образом, данная наиболее часто воспроизводимая синонимичная мутация повторялась в обеих группах с одинаковой частотой (p-value=0,960; df=1; χ²=0,00256; n=83).

Обсуждение

В 48 случаях ИСП из 66 отмечались множественные и единичные точечные мутации, характеризуемые как генетическая гетерогенность, что наиболее наглядно можно было наблюдать на хроматограммах в виде «двойных накладывающихся кривых» и косвенно — при иммуногистохимическом методе с использованием антитела к EGFR. Так, ранее было описано несколько путей развития генетической гетерогенности, один из них описан в концепции полевой канцеризации, которая утверждает, что различные субклоны опухоли могут развиваться независимо от поля генетически измененных предопухолевых клеток [9]. Этот механизм образования опухолей был показан при карциноме ротовой полости [10] и других видах рака головы и шеи [11]. Воздействие вредных агентов может приводить к нескольким мутациям, в результате которых различные клетки, инициирующие опухоль, дают одновременное начало различным субклонам. Существует два предполагаемых механизма полевой канцеризации: так называемая линейная эволюция (моноклональная), где говорится, что в исходной опухоли дополнительные мутационные события приводят к появлению новых субклонов, которые со временем демонстрируют преимущества в росте по сравнению с исходными опухолевыми клетками, и так называемая разветвленная эволюция (поликлональная), где опухоль поражается различными мутационными событиями, каждое из которых приводит к появлению новых субклонов, которые одновременно развиваются в различных областях. Полученные данные не противоречат этой теории.

Заключение

Таким образом, в нашем исследовании при секвенировании по Сэнгеру 20-го экзона гена EGFR в группе ИСП в 16 случаях из 66 были выявлены различные миссенс-мутации, приводящие к изменению значения кодирующей последовательности гена, определяя в конечном счете образование другой аминокислоты; в группе ОСП данный тип мутации выявлен не был. Наиболее часто встречалась мутация в позиции 2622 в виде транзиции G на A: в 47 (70%) случаях ИСП и в 12 (71%) — ОСП. Данная мутация являлась синонимичной и не приводила к замене аминокислоты в синтезируемом белке. Таким образом, в отличие от ранее проведенных другими авторами исследований достоверных различий в 20-м экзоне гена EGFR между группой ИСП и ОСП обнаружено не было.

В группе ИСП в 48 из 66 случаев отмечались множественные и единичные точечные мутации, характеризующиеся как генетическая гетерогенность, что подтверждалось иммуногистохимическим исследованием.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Бахтин А.А., Туманова Е.Л.

Сбор и обработка материала — Бахтин А.А., Сапегина О.А.

Статистическая обработка — Сапегина О.А.

Написание текста — Бахтин А.А., Демкин В.В., Казаков А.А.

Редактирование — Сапегина О.А., Дайхес Н.А., Карнеева О.В.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.