Появление иммунотерапии злокачественных опухолей стало революционным открытием в последнее десятилетие. Термином «контрольные точки иммунного ответа» (immune checkpoint) обозначают различные сигнальные пути, которые ограничивают иммунный ответ и способствуют поддержке иммунологической толерантности [1]. Наиболее изученными рецепторами контрольных точек являются цитотоксический T-лимфоцитарный антиген 4 (CTLA-4, CD152) и белок программируемой клеточной смерти 1 (PD-1 — programmed cell death protein 1, CD279). PD-1 — рецептор, экспрессируемый активированными T-лимфоцитами, в результате его взаимодействия с лигандом (PD-L1 или PD-L2) угнетается активность T-лимфоцитов и происходит их апоптоз. Для клинического использования одобрены анти-PD1 антитела (ниволумаб, Nivolumab; пембролизумаб, Pembrolizumab) [2]. Показано, что эти препараты уменьшают количество регуляторных T-лимфоцитов и оказывают иммуностимулирующее действие, увеличивают количество опухолеспецифичных цитотоксических T-лимфоцитов. Эффективность этих биотерапевтических препаратов показана при лечении меланомы, рака легких, рака мочевого пузыря, рака желудка, различных лимфом и т.д. [3].

Однако в последние годы появляется все больше данных, свидетельствующих, что ответ на это лечение наблюдается только у узкой когорты пациентов [4]. Данные клинические ограничения связаны с большим количеством особенностей как опухоли, так и ее иммунного микроокружения [5]. Для увеличения эффективности иммунотерапии разрабатываются и создаются комбинированные препараты, содержащие иммуногенные субстанции, ингибиторы PD-L1, а также гиалуроновую кислоту как лиганд для белка CD44 [6], экспрессирующегося во многих опухолях человека [7, 8]. Однако вопрос коэкспрессии CD44 и PD-L1 остается малоизученным в литературе.

CD44 — семейство трансмембранных белков с многочисленными функциями [9, 10]. Ген CD44 содержит 21 экзон. Первые и последние 5 экзонов экспрессируются консервативно [11], а центральные 11 могут подвергаться альтернативному сплайсингу с появлением большого количества гликозилированных белков, названных изоформами CD44 [9]. Самая длинная изоформа CD44, содержащая 8 экзонов вариабельного региона (3—10), была обнаружена в кератиноцитах. Самая маленькая молекула CD44, в которой отсутствует весь вариабельный участок, называется стандартной CD44 (CD44s). Поскольку она экспрессируется главным образом на гемо- или лимфопоэтических клетках, она также известна как hematopoietic CD44 (CD44H). Изоформа CD44, содержащая продукты последних трех вариабельных экзонов (с 8-го по 10-й) известна как эпителиальная (CD44Е), преимущественно экспрессируется на эпителиальных клетках [11].

CD44 — рецептор, вовлеченный во взаимодействия клетки с матриксом, межклеточные взаимодействия, а также клеточную адгезию и миграцию, процесс миграции циркулирующих лимфоцитов в лимфоидную ткань [12], презентацию хемокинов и ростовых факторов, передачу ростовых сигналов. CD44 участвует в захвате и деградации гиалуроновой кислоты, а также в передаче сигналов апоптоза [11]. Например, после иммунологической стимуляции T-лимфоциты и другие лейкоциты временно экспрессируют изоформы CD44. Эти функции очень важны для развития таких процессов, как хроническое воспаление и канцерогенез. С помощью CD44 лейкоциты взаимодействуют с сосудистой стенкой в очагах воспаления [9].

Гиалуроновая кислота (hyaluronic acid, HA) — это линейный высокомолекулярный гликозаминогликан, состоящий из повторяющихся дисахаридных единиц N-ацетил-глюкозамина и глюкуроновой кислоты. Гиалуроновая кислота синтезируется HA-синтазой 1-го типа, а также 2-го и 3-го. Молекулы гиалуроновой кислоты связываются с рецепторами на поверхности клеток (CD44, CD168, LVEHR-1, стабилин-2, Toll-like рецептор и др.) [13]. Взаимодействие гиалуроновой кислоты с рецепторами оказывает влияние на межклеточную сигнализацию, пролиферацию клеток, их подвижность и другие процессы [14]. Уровень гиалуроновой кислоты повышается во многих злокачественных опухолях, что связано с неблагоприятным прогнозом [6].

Гиалуроновая кислота — важный компонент внутриклеточного матрикса, является главным, но не единственным лигандом для CD44 [15]. Другими лигандами CD44 являются компоненты внеклеточного матрикса: коллаген, ламинин, фибронектин и хондроитинсульфат. Дополнительными, не связанными с внеклеточным матриксом лигандами являются: аддрессин, серглицин, остеопонтин и the class II invariant chain (Ii). Во многих случаях CD44 не связывается с гиалуроновой кислотой, пока она не будет активирована форболовыми эфирами, которые в свою очередь активируются анти-CD44-антителами, или дегликозилирована (например, с помощью туникамицина) [11].

Многие раковые клетки, так же как и клетки метастазов, экспрессируют высокий уровень CD44. В то время как одни опухоли, например глиомы, продуцируют только один вид CD44 (стандартный), другие (включая рак желудочно-кишечного тракта, мочевого пузыря, шейки матки, молочной железы и неходжкинскую лимфому) — также экспрессируют изоформы CD44. На моделях животных показано, что инъекция веществ, влияющих на CD44 (e.g., CD44s- или CD44v-specific antibodies), угнетает локальный рост опухоли и распространение метастазов. Таким образом, CD44 может предоставлять опухолевым клеткам преимущество в росте и быть использован как мишень в противораковой терапии [11]. Сообщения об его экспрессии противоречивы [16].

CD44 считается маркером опухолевых стволовых клеток (cancer stem cells, CSC) [17]. CSC являются обязательным компонентом любой опухолевой популяции и связаны с инициацией опухолевого роста, прогрессией, метастазированием и рецидивированием опухолей [18—21]. Модель развития опухоли из CSC предполагает, что формирование опухоли, поддержание ее жизнедеятельности и рост регулируются небольшой популяцией долгоживущих клеток с неограниченным потенциалом к пролиферации и дифференцировке в другие виды опухолевых клеток. В литературе [22] имеются данные о том, что CSC дают иммуносупрессивный эффект и мешают распознаванию опухолевых клеток иммунной системой, однако клинические последствия связи между инфильтрацией CD8+ T-клетками, экспрессией лиганда рецептора запрограммированной смерти-1 (PD-L1) и существованием CSC плохо изучены при раке желудка. Стволовые CD44-позитивные клетки в культурах клеток рака желудка демонстрировали большую туморогенность на мышах и in vitro, а также нечувствительность к химиотерапии и радиотерапии [17].

Связь экспрессии CD44 и PD-L1

Связь экспрессии CD44 и PD-L1 показана во многих видах новообразований. Так, A. Alsuliman и соавт. [23] отметили снижение экспрессии PD-L1 в claudin-low подтипе рака молочной железы при реверсии EMT (эпителиально-мезенхимальная трансформация), что проявлялось снижением экспрессии CD44 и виментина и повышением экспрессии CD24. В раке поджелудочной железы также показана коэкспрессия PD-L1 и маркеров опухолевых стволовых клеток CD44 и CD133 [22].

В раке яичника обнаружена корреляция между экспрессией PD-L1 в опухолевых клетках и высоким уровнем экспрессии маркеров стволовых клеток (CD44 и LGR5). Авторы предполагают, что ингибирование PD-L1 среди прочего может приводить к снижению не только активности популяции опухолевых стволовых клеток, но и, таким образом, к уменьшению вероятности рецидива заболевания [24]. В этой же работе анализ выживаемости показал, что положительная экспрессия CD44 ассоциирована с лучшим прогнозом для всей выборки, а также для PD-L1-негативных раков яичника (HR=1,6, 95% ДИ [0,7—3,7] и HR=2,4, 95% ДИ [0,74—7,9] соответственно), а для PD-L1-позитивных опухолей она, наоборот, связана с неблагоприятным прогнозом (HR=0,8, 95% ДИ [1—6,7]).

В плоскоклеточном раке головы и шеи маркер CD44 экспрессировался в устойчивой популяции клеток, связанных с резистентностью к лучевой и химиотерапии и характеризующихся иммуносупрессивным фенотипом. Данные клетки демонстрировали селективную экспрессию PD-L1 [25].

Интересные данные получены при изучении колоректального рака. F. Wei и соавт. [26] наблюдали выраженную экспрессию PD-L1 в CD133(+)CD44(+) колоректальных CSC и опухолевых сфероидах, обогащенных CSC. Изменение экспрессии PD-L1 способствовало самообновлению колоректальных CSC за счет увеличения экспрессии генов стволовости, размеров клеточной популяции CD133(+)CD44(+) и способности формировать опухолевые сфероиды. Авторы считают, что PD-L1 напрямую взаимодействует с HMGA1, это приводит к активации HMGA1-зависимых путей, включая пути PI3K/Akt и MEK/ERK, и способствует экспансии CSC. Экспрессия PD-L1 коррелировала с таковой маркеров CSC и HMGA1 в клинических образцах CRC. Таким образом, PD-L1 может вносить решающий вклад в поддержание самообновления CSC путем активации HMGA1-зависимых сигнальных путей [26].

В немелкоклеточном раке легкого, по данным нескольких исследователей [3, 27, 28], обнаружена положительная связь между экспрессией CD44 и PD-L1. N. Unver и соавт. [28] обнаружили, что PD-L1 положительно коррелирует с экспрессией CD44 и отрицательно коррелирует с экспрессией ALDH1A1 (Pearson r=0,44, r= –0,48 соответственно) в клетках немелкоклеточного рака легкого с мутацией K-Ras. M. Moutafi и соавт. [27] показали, что у пациентов с продвинутыми стадиями немелкоклеточного рака легких, которые получали анти-PD-L1-терапию, экспрессия CD44 была связана с большей общей выживаемостью. Более того, положительная экспрессия CD44 в опухолевом компартменте, а не в иммунном, была связана с благоприятным клиническим эффектом терапии. Положительная экспрессия CD44 не демонстрировала влияние на прогноз у нелеченых пациентов. Помимо этого, C. Zhang и соавт. [3] показали, что при аденокарциноме легкого уменьшение экспрессии CD44 было связано с инфильтрацией B-клетками, CD4(+) T-клетками, нейтрофилами и дендритными клетками. При этом покоящиеся CD4(+) T-клетки, клетка памяти и тучные клетки не демонстрировали такой связи. Однако C. Zhang и соавт. [3] продемонстрировали, что у пациентов с более высоким уровнем CD44 ухудшалась общая выживаемость

Механизмы взаимодействия PD-L1 и CD44

CD44 был идентифицирован как регулятор запрограммированного лиганда смерти 1 (PD-L1) на уровне как белка, так и матричной РНК, при этом показано, что он способствует опосредованной PD-L1 супрессии T-клеток в доклинических моделях [27].

На культурах клеток, а также на гистологическом материале тройного негативного рака молочной железы (ТНРМЖ) и немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) показано, что CD44 активирует транскрипцию гена PD-L1 при помощи цитоплазматичекого домена (ICD), который связывается с регуляторным регионом одного из локусов гена PD-L1, содержащим CD44-ICD-связывающий сайт [29]. Также показано, что CD44-ICD взаимодействует с промоторным участком гена PD-L1. Несмотря на отсутствие в этом регионе CD44-ICD-связывающих сайтов, здесь обнаружен CREB1-связывающий регион. Ранее было показано, что CD44-ICD может взаимодействовать с CREB-связывающим белком (CBP)/p300 для активации транскрипции гена CCND1 [30, 31]. Возможно, такой же механизм наблюдается и при активации PD-L1. Эта гипотеза подтверждается данными о том, что супрессия CREB1 сокращает экспрессию PD-L1 в культурах клеток [29]. Благодаря генетическому взаимодействию экспрессия CD44 положительно коррелирует с экспрессией PD-L1 на уровне мРНК и белков в образцах первичных опухолей ТНРМЖ и НМРЛ.

Таким образом, CD44 оказывает положительное регуляторное влияние на экспрессию PD-L1 в ТНРМЖ и НМРЛ. Поэтому онкогенность CD44, считающегося каноническим маркером опухолевых стволовых клеток, возможно, отчасти обусловлена усилением экспрессии PD-L1, который регулирует пролиферацию клеток и процессы уклонения от иммунной системы. В литературе [32, 33] есть данные, что CSC связаны с иммуносупрессией в опухоли, а активация CD44 гиалуроновой кислотой увеличивает инфильтрацию опухолеассоциированными макрофагами, которые сами по себе замедляют иммунный ответ. Помимо этого, экспрессия PD-L1 связана с резистентностью к химиотерапии при раке молочной железы и простаты, что тоже может быть обусловлено влиянием CSC [34].

Иной взгляд на механизм взаимодействия CD44 и PD-L1 представлен в статье Y. Lee и соавт. [25]. В данном исследовании CD44-позитивные клетки плоскоклеточного рака отличались ЕМТ-фенотипом и были менее иммуногенными, чем CD44-негативные клетки, что показано на модели совместной культивации с аутологичными CD8+ опухолеинфильтрирующими лимфоцитами. В CD44-позитивных клетках наблюдались селективная экспрессия PD-L1 и высокий уровень фосфорилирования STAT3 по сравнению с CD44-негативными клетками. Важно, что ингибирование STAT3 снижало экспрессию PD-L1 в CD44-позитивных клетках. Добавление IFN-γ к культуре клеток усиливало экспрессию PD-L1 на CD44-позитивных клетках и было связано с увеличением экспрессии рецептора IFN-γ и фосфорилированием STAT1. Пониженная иммуногенность CD44-позитивных клеток была частично обратимой в случае блокады рецептора PD-1, что доказывает клиническую и биологическую ценность различий в экспрессии PD-L1 между CD44-позитивными и CD44-негативными клетками. Таким образом, в данном исследовании показан механизм, с помощью которого долгоживущие CD44-позитивные клетки могут селективно влиять на иммунный ответ организма против опухоли, что дает основания к применению адъювантной терапии при плоскоклеточном раке головы и шеи.

Недавно сообщалось [29], что PD-L1 преимущественно экспрессируется на опухолевых клетках с высоким уровнем CD44 при карциноме головы и шеи и раке легких для подавления T-клеточного иммунитета, что обеспечивает новую основу для разработки таргетных препаратов против CD44. Хотя CD44 широко известен как маркер опухолевых стволовых клеток, высокий уровень CD44 также был обнаружен в дендритных клетках [35], он играет важную роль в иммунологических функциях дендритных клеток, таких как костимуляция активации T-клеток в опухолях [36]. Таким образом, экспрессия PD-L1 на CD44-high опухолевых и дендритных клетках участвует в уклонении опухоли от адаптивного иммунного ответа организма хозяина. Более того, гиалуроновая кислота как лиганд CD44 может служить идеальной мишенью для двойной блокады пути PD-L1 не только на дендритных, но и на опухолевых клетках, тем самым перепрограммируя опухолевое микроокружение на индукцию сильного опухолеспецифического иммунитета.

Новый подход к разработке таргетной иммунотерапии на основе PD-L1 и CD44

В данный момент имеется несколько экспериментальных исследований по разработке векторных наночастиц, которые могут быть использованы для таргетной терапии опухолей, экспрессирующих CD44 [37—42]. J. Lee и соавт. [40] сконструировали мультитаргетную молекулу (HNC0014), которая подавляет опухолевый рост, воздействуя на c-Met, STAT3, PD-L1 и CD44 при раке головы и шеи. L. Qian и соавт. [43] разработали наночастицы, снижающие экспрессию PD-L1 в культуре клеток карциномы желудка, и показали одновременное снижение экспрессии CD44. X. Wang и соавт. [44] в 2022 г. предложили новый терапевтический подход к терапии диссеминированного рака желудка, также ориентируясь на маркеры опухолевых стволовых клеток (CD44, CD133) и PD-L1.

S. Kim и соавт. [39] создали полимерные конъюгаты, состоящие из куриного овальбумина (OVA), гиалуроновой кислоты (HA) и инкапсулированных малых интерферирующих РНК (siRNA) против PD-L1, и показали, что данные частицы эффективно амплифицируют иммунный ответ благодаря воздействию на CD44+ опухолевые и дендритные клетки. Конъюгат с двойным нацеливанием не только способствует апоптозу опухолевых клеток, опосредованному экзогенными антигенспецифическими T-клетками, но также индуцирует высвобождение эндогенных опухолевых антигенов, усиливая T-клеточный ответ. Кроме того, доставка siRNA в CD44+ опухолевые и дендритные клетки активизирует функцию T-клеток, тем самым обеспечивая длительный противоопухолевый иммунитет и защиту от опухоли. В совокупности эта стратегия терапевтической системы на основе полимерных конъюгатов с двойной мишенью может служить клинически применимой платформой для иммунотерапии рака.

Заключение

Взаимодействие PD-L1 с CD44 является ключевым звеном для совершенствования методов иммунотерапии злокачественных образований. В последнее время значительно возросло количество разработок, направленных на усиление активности иммунотерапии, в том числе с использованием CD44. Таким образом, очевидно, что необходимо более углубленно изучать закономерности экспрессии CD44 и других маркеров опухолевых стволовых клеток (например, CD133) и их связь с экспрессией PD-L1.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.