Микроорганизмы представляют собой неотъемлемую часть организма человека. Они формируют микробные сообщества, вступают в симбиоз с организмом хозяина и выполняют многочисленные функции, способствующие нормальной жизнедеятельности [1, 2]. Изменение состава микробных сообществ может повлечь за собой развитие различных заболеваний [3].
Геномные исследования позволили по-новому взглянуть на проблему микробных сообществ в организме человека и изучить механизмы взаимодействия между ними. Широко используемыми методами изучения микробных сообществ считаются исследование последовательности генов и метагеномный анализ. Благодаря этим методам была обнаружена бактериальная ДНК в тканях печени, жировой ткани и крови [4]. Новые знания позволили выдвинуть предположение о существовании микробиоты в организме человека — тканевой микробиоты (ТМ). Нарушение микробного состава ТМ связано с развитием различных заболеваний, таких как рак легких, неалкогольная жировая дистрофия печени, рак молочной железы [5—7].
Методы исследования ТМ имеют важные технические ограничения, которые могут искажать результаты. В основном ограничения связаны со сбором и хранением образцов, экстракцией нуклеиновых кислот, амплифицирующими праймерами, технологией секвенирования, длиной и глубиной считывания, методами биоинформатического анализа [8]. Одной из проблем считаются контаминирующие микробные нуклеиновые кислоты во время подготовки образца. Возможные источники контаминации: вода для секвенирования, реагенты для ПЦР и сами наборы для выделения нуклеиновых кислот [9, 10]. Ранее сообщалось о загрязняющих последовательностях, соответствующих роду бактерий, связанных с водой и почвой, включая Acinetobacter, Alcaligenes, Bacillus, Bradyrhizobium, Herbaspirillum, Legionella, Leifsonia, Mesorhizobium, Methylobacterium, Microbacterium, Novosphingobium, Pseudomonas, Ralstonia, Sphingomonas, Stenotrophomonas и Xanthomonas [9]. Контаминация образцов представляет особую проблему для исследователей, работающих с материалом, содержащим низкую микробную массу. В этих случаях небольшое количество исследуемого исходного материала (например, из ткани человека) может быть вытеснено контаминантом, что приведет к вводящим в заблуждение результатам. Многие из истинных сигналов (там, где они присутствуют) маскируются контаминантами, присутствующими в наборах для экстракции, амплификации и подготовки библиотек [11].
Несмотря на возможность «загрязнения» тканей экзогенными микроорганизмами и их генетическим материалом, необходимо накапливать знания о результатах секвенирования для дальнейшей характеристики патогенов и микробных сообществ. Это позволит расширить взгляды на механизмы патогенеза и, возможно, причины некоторых патологических состояний.
Цель исследования — изучить результаты метагеномного транскриптомного анализа криоконсервированных образцов лимфатических узлов с фолликулярной лимфомой (ФЛ) и реактивной фолликулярной гиперплазией (РФГ) с определением качественного и количественного состава микробиоты в исследуемых группах, а также проанализировать разнообразие микробного состава в двух когортах, учитывая анатомическую локализацию удаленного лимфатического узла, возраст и пол пациентов.
Материал и методы
В работу включены 38 биопсийных образцов лимфатических узлов с фолликулярной лимфомой (цитологических подтипов 1—2, 3A, 3B) и 10 биопсийных образцов лимфатических узлов с реактивной фолликулярной гиперплазией.
От всех пациентов получено информированное согласие на хранение образцов и использование их для молекулярно-биологических исследований в научных целях. Часть лимфатического узла замораживали в жидком азоте с применением криопротектора не позднее, чем через 2 ч после проведения биопсии. Из оставшейся ткани образца были приготовлены парафиновые блоки по стандартной методике. Из парафиновых блоков на ротационном микротоме изготавливали срезы толщиной 3—4 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином, азур II-эозином. При иммуногистохимическом окрашивании использовали первичные антитела к CD3, CD5, CD10, CD20, BCL-2, BCL-6, циклину D1 фирм «Cell Marque» (США) и «Thermo Scientific» (США). Докрашивание гематоксилином, дегидратацию и заключение под покровное стекло гистологических препаратов выполняли по стандартной методике. Полученные микропрепараты использовали для морфологической верификации патологического процесса [12, 13].
Подготовка библиотек РНК и секвенирование
Для полнотранскриптомного анализа РНК выделяли из криоконсервированных образцов лимфатических узлов реактивом TRIZOLTM («Invitrogen», США). Библиотеки готовили согласно рекомендациям производителя с помощью набора TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit for Illumina (with Ribo-Zero Human/Mouse/Rat) («Illumina», США). Секвенирование проводили на секвенаторе HiSeq 2500 («Illumina», США). Контроль качества полученных данных осуществляли с помощью программы FastQC [14]. Прочтения низкого качества отфильтровывали и удаляли инструментом Trimmomatic [15].
Последовательности РНК в образцах, прошедшие контроль качества прочтения, анализировали с помощью метагеномного классификатора Centrifuge [16]. Программа сравнивала каждую отдельную последовательность с библиотеками референсных геномов известных бактерий, вирусов и при совпадении классифицировала ее как относящуюся к определенному биологическому виду. Затем проводился подсчет количества последовательностей РНК в образце в каждом метагеномном классе. Результаты позволили описать видовой состав микробиома в образце и количественно оценить представленность каждого из видов микроорганизмов.
Анализ данных
Анализ и визуализацию полученных данных осуществляли с помощью языка программирования R (версия 4.2.1) с использованием пакетов: vegan, PCAtools, dplyr, ggplot2.
Результаты
Клинические характеристики пациентов
При исследовании полученных результатов (см. таблицу) в двух группах заметно отличается возраст пациентов. Группа ФЛ в подавляющем числе состоит из лиц пожилого возраста, в группу РФГ вошли пациенты средних лет согласно критериям ВОЗ.
Клиническая характеристика пациентов
| Характеристика | Фолликулярная лимфома | Гиперплазия | p |
| Всего пациентов | 38 | 10 | |
| Возраст, годы | 56,1±5,0 | 60,0±5,2 | 0,003* |
| Пол: | |||
| мужской | 20 | 5 | 0,551 |
| женский | 28 | 5 | |
| Локализация лимфатических узлов: | |||
| забрюшинное пространство | 1 | 0 | 0,567 |
| подмышечная область | 13 | 3 | |
| паховая область | 8 | 2 | |
| бедренная область | 2 | 0 | |
| средостение | 2 | 1 | |
| область шеи | 18 | 3 | |
| слюнная железа | 1 | 0 | |
| поднижнечелюстная область | 1 | 1 | |
| надключичная область | 2 | 0 |
Примечание. Для расчета показателя p использовали метод χ2 Пирсона; *— p подсчитывали с помощью метода Манна—Уитни.
Индексы разнообразия
В исследованных образцах обнаружены фрагменты РНК, последовательности которых классифицированы как принадлежащие 4241 виду микроорганизмов. Для сравнения опухолевой и неопухолевой ткани по представленным различным таксономическим единицам микроорганизмов использовали индексы разнообразия, которые считаются мерой биоразнообразия в пределах одной экосистемы, характеризуя количество и обилие видов в определенном сообществе. Сравнение индексов альфа-разнообразия в опухолевых и неопухолевых тканях лимфатических узлов представлено на рис. 1.
Рис. 1. Сравнение индексов разнообразия Симпсона и Шеннона в группах с диагнозами реактивной фолликулярной гиперплазии и фолликулярной лимфомы.
Опухолевые лимфатические узлы характеризуются большим значением альфа-разнообразия Симпсона (p-value=0,026465) и Шеннона (p-value=0,007122). При сравнении локализации лимфатических узлов и пола пациентов по значениям индекса альфа-разнообразия статистически значимых различий не обнаружено (p>0,05).
Чтобы визуализировать различия в составе сообществ между образцами установлено бета-разнообразие. Значения NMDS подсчитаны на основе дистанции Hellinger. На графике (рис. 2) видны две хорошо различимые группы. В обоих кластерах присутствуют как опухолевые, так и неопухолевые образцы, однако их соотношение значительно различается между кластерами. В первой группе представлены преимущественно опухолевые образцы.
Рис. 2. Бета-разнообразие, основанное на дистанции Hellinger в группах с диагнозами реактивной фолликулярной гиперплазии (Normal) и фолликулярной лимфомы (Tumor) всех цитологических подтипов.
Сравнение относительного изобилия
Относительное изобилие позволяет оценить, насколько распространен или редок изучаемый вид по сравнению с остальными таксонами в экосистеме. Наибольшее относительное изобилие наблюдалось (RA>0,001) у 72 из 4241 таксона. В результате анализа относительного изобилия методом главных компонент и построения тепловой карты с филогенетическим деревом выделялось 2 кластера (см. рис. 1). Характерно, что в кластере 2 наблюдалось большее содержание транскриптов следующих микроорганизмов: Bradyrhizobium sp. SK17, Clostridium botulinum, Escherichia coli, Escherichia albertii, Salmonella virus SP6, Yersinia enterocolitica, Streptomyces gilvosporeus, Proteus mirabilis (p<0,001). Эти таксоны представляют собой отдельную совокупность микроорганизмов, вносящих наибольшее различие между двумя кластерами. Количество таксонов, от Natrialbaceae archaeon до Melaminivora sp. SC2.7, в кластере 2 встречается значительно реже.
Наличие некоторых микроорганизмов, таких как Bradyrhizobium sp., Natrialbaceae archaenon, Natrealbaceae archaeon, и других таксонов может быть результатом контаминации образцов на стадии пробоподготовки материала.
Обсуждение
В исследовании были проанализированы качественные и количественные характеристики РНК микробиоты опухолевых и неопухолевых лимфатических узлов. Обнаружены статистически достоверные различия между альфа-разнообразием в двух исследуемых группах, а также гетерогенность ТМ фолликулярных лимфом внутри группы, не связанной со степенью злокачественности. Это свидетельствует о возможном неучтенном факторе, влияющем на видовой состав микробиоты. Различий по полу пациентов и локализации лимфатических узлов не обнаружено.
Полученные результаты согласуются с исследованиями [17], в которых были найдены статистически значимые различия между разнообразием микроорганизмов в фекалиях и наличием определенной подгруппы лимфом. Объяснение результатов с позиции повышения кишечной проницаемости и, как следствие, проникновение в кровеносную и лимфатическую систему пептидогликанов и липополисахаридов бактерий, в исходе которого лежит развитие опухоли, дополняется полученными результатами. Проникновение не только продуктов бактериального распада, но и самих микроорганизмов в кровь и лимфу, а также реакция иммунной системы могут быть связаны с развитием опухолевого процесса. Отсутствие связи между принадлежностью лимфатических узлов к определенной анатомической зоне открывает поле для дискуссии о путях проникновения транскриптов или микроорганизмов в лимфатическую систему человека.
Различия в ТМ опухолевых и неопухолевых лимфатических узлов могут объясняться и с позиции нарушения функционирования иммунной системы, характерного для развития злокачественных новообразований. В ответ на проникновение микроорганизма в лимфатический узел вследствие иммуносупрессии не возникает достаточного иммунного ответа для его элиминации, что объясняет увеличение альфа-разнообразия в опухолевых лимфатических узлах.
Стоит отметить возможное влияние контаминации на состав ТМ в исследовании. Различные виды микроорганизмов, представленные выше, обитают в почве, проточной воде, инструментах и приборах для пробоподготовки. Это может объяснять бо́льшую гетерогенность состава ТМ внутри групп.
Заключение
Обнаруженные различия в ТМ лимфатических узлов с гиперплазией и ФЛ позволяют считать целесообразными дальнейшие исследования с целью установления механизмов патогенеза и причин развития опухолей лимфоидной ткани. Внутригрупповая изменчивость по составу микробиоты лимфатических узлов, возможно, связана с комплексом факторов, определяющих патологический процесс.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Н.С. Гладышев, Ю.А. Криволапов
Сбор и обработка материала — Н.С. Гладышев, Д.В. Барам, А.В. Горбунов
Написание текста — Н.С. Гладышев, Д.В. Барам, Ю.А. Криволапов
Редактирование — Ю.А. Криволапов, А.В. Горбунов, Д.В. Барам
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.