Рак внепеченочных желчных протоков отличается крайне агрессивным течением. Для заболевания характерны раннее метастазирование, высокая частота возникновения рецидива после радикального хирургического лечения и, как следствие, высокая летальность [1]. Существующие схемы лекарственной терапии не обладают достаточной эффективностью.

Основные пусковые факторы процесса злокачественной трансформации холангиоцитов — хроническое воспаление желчных протоков и холестаз [1, 2]. Это приводит к нарушению клеточной пролиферации и клеточного цикла, а также подавляет апоптоз. Накопление желчных кислот в результате холестаза приводит к снижению pH, активации сигнальных путей ERK1/2, Akt и NF-κB, которые стимулируют пролиферацию, миграцию и выживание клеток [3]. P.L. Labib и соавт. в обзорной статье [1], посвященной молекулярному патогенезу холангиокарциномы, отмечают такие медиаторы воспаления, как трансформирующий фактор роста-β, фактор роста эндотелия сосудов, фактор роста гепатоцитов, некоторые микроРНК. Повышенная экспрессия на клеточной поверхности рецептора c-Met, транспортера глюкозы GLUT-1 и симпортера йодида натрия приводит к росту опухоли, ангиогенезу и миграции клеток. Наблюдаются также стромальные изменения, вызывающие изменения в составе внеклеточного матрикса и рекрутирование фибробластов и макрофагов, которые создают микроокружение, способствующее выживанию, инвазии и метастазированию клеток [1].

Известно, что этиология и патогенез опухолевого роста связаны с усилением экспрессии протоонкогенов и подавлением генов онкосупрессоров, ведущих к неконтролируемой пролиферации, «уходу» от апоптоза, нарушению метаболизма опухолевой ткани. Причиной изменения экспрессии могут быть мутации, эпигенетические факторы, воздействие вирусов и транспозонов [4].

Мутации генов, участвующих в регуляции клеточного цикла и апоптоза, играют важную роль в патогенезе холангиокарциномы. По данным Б.Д. Гурмикова и соавт. [3], мутации гена TP53 обнаружены у 21% больных раком желчных протоков. Мутации гена KRAS выявлены у 40% больных раком внепеченочных желчных протоков, изоцитратдегидрогеназы-1 и -2 (IDH1/2) — у 7% больных.

Мутации в генах изоцитратдегидрогеназ, факторах связывания и ремоделирования хроматина (ARID1A, BAP1, PBRM1, SMARCB1) встречаются в одной трети случаев холангиокарциномы. Эпигенетические изменения в генах, контролирующих сигнальные пути, также играют важную роль в холангиоканцерогенезе. Так, при холангиокарциноме часто обнаруживается гиперметилирование в гене SOCS3 (suppressor of cytokine signaling 3) [5] и ассоциированное с этим усиление экспрессии Mcl1 [6]. В 85% случаев холангиокарциномы установлено гиперметилирование промоторного CpG-островка гена SFRP1, участвующего в регуляции WNT-сигнального пути [7, 8].

Таким образом, можно выделить медиаторы воспаления, генные мутации и эпигенетические изменения как факторы молекулярного патогенеза холангиокарциномы [8].

Медиаторы воспаления

Хроническое воспаление — один из ключевых факторов холангиоканцерогенеза. Высокая концентрация медиаторов воспаления (цитокины, факторы роста опухоли, циклооксигеназа-2) индуцирует мутации ДНК, генов онкосупрессров и онкогенов, что обусловливает развитие опухоли [2].

Роль интерлейкина 6 (IL-6)

IL-6 является ключевым цитокином в патогенезе холангиокарциномы, оказывая влияние на пролиферацию и апоптоз клеток холангиокарциномы (рис. 1). Под действием IL-6 активируется сигнальный путь JAK-STAT [2, 4]. В нормальных холангиоцитах регуляция сигнального пути JAK-STAT происходит по типу отрицательной обратной связи путем синтеза цитокина — супрессора SOCS3, дефосфорилирующего JAK-киназы [9]. При холангиокарциноме отмечается снижение синтеза SOCS3 [9]. IL-6 активирует STAT-3, что ведет к увеличению экспрессии антиапоптотического белка Mcl1. Это делает клетки холангиокарциномы устойчивыми к стандартной терапии [2].

Рис. 1. Роль IL-6 в патогенезе холангиокарциномы [13].

IL-6 подавляет специфические микроРНК, что приводит к увеличению транскрипции фермента DNMT1 (DNA methyltransferase 1). Этот фермент участвует в процессах метилирования цитозинов ДНК, что в свою очередь приводит к снижению экспрессии генов-супрессоров опухоли [10].

Активация p44/42 и p38 MAPK под действием IL-6 вызывает пролиферацию и снижение экспрессии медиатора клеточного старения p21 [11, 12].

Отмечено, что IL-6 воздействует на длину теломер путем повышения активности теломеразы во время митоза, что позволяет клеткам уклоняться от клеточного старения, а также опосредует гиперэкспрессию EGFR [13]. T. Shimura и соавт. [14] сообщают, что уровень сывороточного IL-6 у больных внепеченочной холангиокарциномой достоверно выше, чем в группе здоровых людей.

Роль COX2 и оксида азота

Активация p44/42 и p38 МАРК вызывает увеличенный синтез циклооксигеназы-2, что приводит к угнетению апоптоза и повышению пролиферативной активности. Кроме того, экспрессию гена COX2 индуцирует тирозинкиназа Erb-2 [15, 16]. Еще одним механизмом влияния на рост продукции COX2 является синтаза оксида азота (iNOS), активирующаяся под действием воспалительных цитокинов. Под действием iNOS происходит гиперпродукция оксида азота, что в свою очередь ведет к дезаминированию ДНК и повреждению ее структуры [17,18]. Повышенное содержание оксида азота запускает трансмембранный рецептор Notch1, который, взаимодействуя с COX2, повышает резистентность клеток к апоптозу (рис. 2). Повышенная активность Notch 1 и COX2 была отмечена при внутри- и внепеченочной холангиокарциноме [19].

Рис. 2. Роль циклооксигеназы-2 и оксида азота в патогенезе холангиокарциномы.

Генные мутации

В исследовании H. Lee и соавт. [20] изучен геномный профиль 99 пациентов с диагнозом рака внепеченочных желчных протоков. У 82 (83%) больных внепеченочной холангиокарциномой были обнаружены мутации следующих генов: KRAS (43%); ERBB2 (9%), PTEN (7%); ATM и NF1 (6%) и CCND1, FBXW7, GNAS, MDM2 и NRAS (все по 5%). Мутации в генах BRAF, BRCA2, CDK4, CDK6, FGFR1, FGFR3, PTCH1, RAF1 и STK11 были выявлены в единичных случаях. Мутаций в генах IDH1 и IDH2 не выявлено [20]. На рис. 3 представлена гистологическая картина умереннодифференцированной аденокарциномы желчного протока с мутацией ERBB2 S310F. Известно, что мутации внеклеточного домена ERBB2 реагируют на таргетную анти-HER2-терапию, что означает возможность ее использования в лечении таких пациентов. Применение двойной блокады HER2 пертузумабом и трастузумабом пока не входит в клинические рекомендации, одобренные Минздравом России, но, как считают многие исследователи, может быть использовано в качестве второй и последующих линий терапии.

Рис. 3. Внепеченочная холангиокарцинома с мутацией ERBB2 S310F. Окраска гематоксилином и эозином [20].

Стоит отдельно подчеркнуть наличие различных профилей мутации генов. Это было показано в исследовании N. Nakamura и соавт. [21], выполненном на гистологическом материале 260 больных холангиокарциномой (внутрипеченочная локализация 145, внепеченочная 86 и желчный пузырь 29). При исследовании внутрипеченочной холангиокарциномы были обнаружены мутации в гене FGFR2, при изучении внепеченочной холангиокарциномы выявлены мутации в генах PRKACA, PRKACB, при раке желчного пузыря найдены нарушения в генах EGFR и/или ERBB3 [21].

В работе A. Ruzzenente и соавт. [22] был проанализирован мутационный статус 56 генов у 91 пациента. При внепеченочной локализации опухоли наиболее часто обнаруживались мутации в генах KRAS (47,4%), TP53 (23,7%), ARIAD1А (15,8%). Отмечено, что мутации в генах ALK, IDH1 и TP53 ассоциированы с худшим прогнозом у пациентов с внепеченочной холангиокарциномой [22].

В обзоре E. Roos и соавт. [23] отмечают, что у больных карциномами билиарного тракта наиболее часто выявлялись мутации в гене TP53 вне зависимости от локализации опухоли. Отдельно изучен генетический профиль у больных раком внепеченочных желчных протоков с использованием полногеномного секвенирования (WES: whole exome sequencing, WGS: whole genome sequencing, TS: targeted sequencing). По результатам WES/WGS секвенирования наиболее часто обнаруживались мутации в генах TP53 (37%), SMAD4 (17%), KRAS (16%), SYNE1(13%) и ARID1A (13%). При исследовании методом TS отмечены мутации в генах TP53 (19%), MUC16 (18%), SACS (15%), KRAS (14%) и FSIP2 (14%). Мутации генов APC, GNAS и TGFB2, характерные для интестинального подтипа опухоли, обнаружены также при раке внепеченочных желчных протоков.

A.F. Brito и соавт. [13] в своей статье также указывают на высокую частоту встречаемости мутации генов KRAS и TP53 и ассоциированный с этим фактором более агрессивный фенотип опухоли. Авторы отмечают выявление гиперэкспрессии тирозинкиназного рецептора EGFR в клетках рака желчных протоков и связанную с этим стимуляцию пролиферации клеток и «уход» от апоптоза.

Эпигенетические факторы

Гиперметилирование ДНК

В ходе исследования эпигенетического профиля преинвазивных опухолей желчных путей были обнаружены ассоциированные со злокачественной трансформацией эпигенетические мутации. В частности, гиперметилирование промотора гена CDKN2A (p16^INK4A) при внутрипротоковой папиллярной неоплазии и HOXA1 при билиарной интраэпителиальной неоплазии [24, 25].

Мутации гена KRAS запускают процессы гиперметилирования CpG-островков, а мутации гена TP53 индуцируют экспрессию гистонметилтрансфераз (HMT), что приводит к модификации хроматина в опухолевых клетках [26].

По данным обзорной статьи S. Kongeptch и соавт. [27], при холангиокарциноме обнаружено гиперметилирование генов CDKN2A (17—83%), p15(INK4b) (54%), p14(ARF) (19—30%), RASSF1A (31—69%) и APC (27—47%). Мутации гена TP53 в образцах с гиперметилированием генов p14(ARF), DAPK и/или ASC ассоциированы с более агрессивным течением болезни и худшей выживаемостью [28]. Гиперметилирование промоторного CpG-островка гена SOX17 служит примером того, как одиночная эпимутация может вызвать дедифференцировку зрелого холангиоцита, увеличение пролиферации, индукцию онкогенов клеточного цикла, инвазию опухоли, возникновение лекарственной резистентности [29].

МикроРНК

МикроРНК представляют собой короткие некодирующие РНК последовательности, участвующие в регуляции экспрессии генов на пост-транскрипционном уровне. Как известно, основная функция микроРНК — нарушение трансляции посредством связывания с определенной последовательностью мРНК, результатом чего является изменение или подавление синтеза белка [30]. Причем степень комплементарности последовательностей между микроРНК и мишенью на мРНК определяет механизм подавления: полная комплементарность приводит к деградации мРНК, а частичная — к подавлению трансляции (рис. 4) [32].

Рис. 4. Степени комплементарности микроРНК [38].

Изменение профиля экспрессии микроРНК в сыворотке и плазме крови отмечено при многих злокачественных опухолях: раке молочной железы, раке легкого, меланоме и др. [30, 32, 33]. При холангиоканцерогенезе также отмечается изменение уровня экспрессии микроРНК. Повышение экспрессии miR-let-7a сопровождается снижением экспрессии гена-супрессора опухоли NF2 и последующей активацией STAT3 [34]. Снижение экспрессии miR-148a и miR-152 приводит к увеличению активности DNMT1, что в свою очередь вызывает метилирование генов-супрессоров опухолей p16INK4a и RASSF1A [18]. Подавление экспрессии miR-370 повышает экспрессию онкогена MAP3K8 [35].

Активация Wnt/β-катенин-сигнального пути из-за продукции лигандов Wnt макрофагами связана с повышенной экспрессией длинной некодирующей РНК uc.158 (днРНК) [36]. Так, днРНК, подобно микроРНК, регулируют экспрессию генов на посттранскрипционном уровне и могут взаимодействовать с микроРНК [37]. ДнРНК uc.158, по-видимому, конкурентно ингибирует miR-193b которая имеет проапоптотическую функцию [36]. Этот механизм может объяснить один из способов, которыми активация пути Wnt/β-catenin приводит к подавлению апоптоза.

Клетки-предшественники и трансформация зрелых холангиоцитов

Билиарные клетки-предшественники служат источником редких комбинированных форм опухоли — комбинированного гепатохолангиоцеллюлярного рака. При геномном анализе этого вида опухоли обнаружены гепатоциты и холангиоциты, экспрессирующие маркеры стволовых клеток (SALL4) [38]. Комбинированный гепатохолангиоцеллюлярный рак и холангиокарцинома с фенотипом, подобным стволовым клеткам, ассоциированы с худшим прогнозом выживаемости пациентов [38]. При этом отмечается, что в нормальных условиях регенерация печени происходит преимущественно через деление зрелых гепатоцитов, а не клеток-предшественников. Напротив, в условиях хронического воспалительного процесса в желчных протоках и печени отмечается активация стволовых клеток, что делает их восприимчивыми к эпигенетическим и генетическим изменениям [39].

Другая модель холангиоканцерогенеза — эпигенетическая и генетическая трансформация зрелых холангиоцитов. Трансформация муцинсекретирующих холангиоцитов характерна для воротной холангиокарциномы, в то время как внутрипеченочная холангиокарцинома может возникать из зрелых или незрелых холангиоцитов, расположенных в междольковых или в крупных желчных протоках. Описано действие генов TP53 и KRAS как эпигенетических модуляторов. Доказано, что введение мутировавших TP53 и KRAS in vivo вызывает трансформацию зрелых холангиоцитов в злокачественную опухоль [34].

Гистоны

Большое количество исследований геномного профиля холангиокарциномы демонстрирует роль метилирования и деметилирования гистонов, а также ремоделирования хроматина в холангиоканцерогенезе. В частности, выявлены мутации в гене ARID1A, кодирующем ДНК-связывающую субъединицу комплекса белков ремоделирования хроматина SWI/SNF [40]. ARID1A обычно оказывает опухолесупрессивное действие, и мутация в нем может вызывать нарушение регуляции клеточного цикла, что приводит к ингибированию апоптоза и неконтролируемой пролиферации клеток (рис. 5) [41]. Инактивация ARID1A и PBRM1 ассоциирована с формированием инвазивного фенотипа опухоли [42].

Рис. 5. Схема патогенеза холангиокарциномы при мутации в гене ARID1A [42].

По данным ряда исследований, при холангиоканцерогенезе обнаружена сверхэкспрессия гистондеацетилаз (HDACs), хотя последствия для генома не были исследованы [43]. Функционально избыточная экспрессия HDAC6 связана с повышенной пролиферацией клеток, угнетением апоптоза, метастазированием и потерей ресничек у холангиоцитов (рис. 6) [44, 45]. EZH2 (энхансер zeste homolog 2), являющийся каталитическим компонентом для метилирования H3K27 через поликомб-репрессивный комплекс 2 (PRC2), также активируется при холангиокарциномах, и уровень его экспрессии положительно коррелирует с неблагоприятным прогнозом [46]. Несмотря на установленные убедительные транскрипционные и мутационные изменения исследователи не смогли оценить (эпи)последствия этих изменений для всего генома. Это требует дальнейшего изучения.

Рис. 6. Последствия избыточной экспрессии HDAC6 [46].

Заключение

Существует большое количество генетических, эпигенетических и других молекулярных факторов развития, роста и прогрессирования холангиокарциномы. В настоящее время доказана роль медиаторов воспаления, в частности, ИЛ-6, ЦОГ-2 и оксида азота, в холангиоканцерогенезе. Подтверждена высокая частота встречаемости мутаций генов KRAS и TP53, выявленных в опухолях внепеченочных желчных протоков.

Установлен комплекс эпигенетических изменений, инициирующих и сопровождающих холангиоканцерогенез. Отмечены эпигенетические маркеры негативного прогноза заболевания. В частности, наличие мутации гена TP53 с гиперметилированием p14ARF, DAPK и/или ASC связано с более агрессивным течением болезни. Инактивация гена SOX17 в результате гиперметилирования его промотора приводит к возникновению лекарственной резистентности. Холангиокарцинома с фенотипом стволовых клеток ассоциирована с худшим прогнозом выживаемости пациентов.

Изучение молекулярно-генетических особенностей рака внепеченочных желчных протоков может помочь глубже понять особенности патогенеза этого вида опухоли, установить новые прогностические и диагностические маркеры заболевания. Возможно, в дальнейшем по мере накопления знаний это позволит индивидуализировать подходы к лечению такой категории больных.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.