Многочисленные исследования последних лет показали, что клетки рака иногда способны уклоняться от иммунного надзора лимфоцитов, окружающих опухоль. Опухолевые клетки могут экспрессировать большое количество сигнальных белков, угнетающих иммунный ответ. Один из наиболее значимых путей супрессирующих иммунитет опосредованно работает через PD-1 (белок запрограммированной клеточной гибели-1) и его лиганд (PD-L1). PD-1 часто экспрессируется на поверхности активированных T-лимфоцитов, моноцитов, на дендритных клетках. PD-L1, в свою очередь, также экспрессируется на иммунных (дендритных клетках, макрофагах, Т- и В-клетках) и на опухолевых клетках.

Вне опухоли рецептор PD-1 взаимодействует с лигандом PD-L1 и развивается иммуносупрессия, которая выполняет роль тормоза в регуляции адаптивного иммунного ответа [1]. Таким образом, взаимодействие между PD-1 и PD-L1 в норме защищает ткани от аутоиммунных поражений, но в микроокружении опухоли этот механизм позволяет опухоли избегать иммунного ответа организма [2].

Исследования показали, что блокирование взаимодействия между PD-1 и PD-L1 убирает иммунный «тормоз»: усиливается T-клеточный ответ и повышается противо-опухолевая активность [3—6].

Тройной негативный рак молочной железы (ТНРМЖ) имеет высокую частоту экспрессии PD-L1 в сравнении с другими подтипами рака молочной железы, что объясняет высокий потенциал терапии, направленной на блокирование PD-L1 [7, 8]. В одном из исследований ТНРМЖ из 41 исследованной опухоли в 12 из них была обнаружена амплификация гена, ответственного за более высокую экспрессию PD-L1 на поверхности клеток. В то же время это генетическое нарушение не выявлено ни в люминальных, ни в HER2-позитивных карциномах [9]. В другом исследовании выявлено, что частота амплификации этого гена выше в базальном подтипе ТНРМЖ по сравнению с другими подтипами [10]. Исследование Н. Ali и соавт. [11] показало, что экспрессия PD-L1 в клетках рака молочной железы хоть и не сильно, но статистически значимо коррелирует с уровнем mRNK.

У пациентов с раком молочной железы экспрессия PD-L1 ассоциируется с неблагоприятным исходом. Один из метаанализов показал, что увеличение уровня экспрессии PD-L1 значимо коррелирует со снижением выживаемости и прогностическими факторами, связанными с повышенными рисками для больных раком молочной железы. Повышенная экспрессия PD-L1 снижает общую выживаемость в 1,5 раза (ОР 1,52 [95% ДИ:1,14, 2,03; р =0,004]), а безрецидивную выживаемость ― в 1,3 раза (ОР 1,31 [95% ДИ:1,14, 1,51; р <0,0001]) [12]. В другом метааналитическом исследовании были объединены данные 2061 пациента из 5 исследований. В результатах отображено, что позитивный статус и увеличение экспрессии PD-L1 связаны с негативным прогнозом для рака молочной железы: риски повышаются в 1,64 раза [95% ДИ: 1,14, 2,34] для общей выживаемости и в 2,53 раза [95% ДИ: 1,78, 3,59] возрастает смертность в течение 10 лет после операции. Более того, положительный PD-L1-статус ассоциировался с риском появления регионарных метастазов (ОР 1,33 [95% ДИ: 1,04, 1,70]), со снижением ядерной дифференцировки (ОР 1,24 [95% ДИ: 1,07, 1,43]) и с негативным гормональным статусом (ОР 2,45 [95% ДИ: 1,31, 4,60]) [13].

Цель анти-PD-L1-иммунотерапии метастатического ТНРМЖ ― увеличить продолжительность жизни пациенток с самой агрессивной формой рака молочной железы и низкой выживаемостью [14]. До появления иммунотерапии медиана общей выживаемости при применении химиотерапии с использованием таксанов и антрациклинов была менее 18 мес [15]. Анти-PD-L1-терапия атезолизумабом в комбинации с наб-паклитакселом позволила достичь медианы общей выживаемости в 25 мес по сравнению с 18 мес в группе монотерапии наб-паклитакселом у пациентов с метастатическим ТНРМЖ при первой линии терапии.

Атезолизумаб является анти-PD-L1-антителом и в клинических исследованиях показал беспрецедентные результаты в терапии не только ТНРМЖ, но и ряда злокачественных опухолей других локализаций: рака легкого, уротелиального рака [1].

Ингибирование пути PD-L1/PD-1 повышает активность T-лимфоцитов по отношению к клеткам опухоли. Этот подход известен как иммунотерапия, основанная на ингибировании контрольных точек иммунитета (PD-L1/PD-1). Механизм действия анти-PD-L1-терапии блокирует передачу сигнала между PD-L1 и PD-1 (рис. 1).

Рис. 1. Механизм действия анти-PD-L1-терапии.

АнГ — антиген. PD-L1 может экспрессироваться на опухолевых клетках и инфильтрирующих опухоль иммунных клетках и участвовать в подавлении противоопухолевого иммунного ответа в микроокружении опухоли. При связывании лиганда PD-L1 (лиганд-рецептора программируемой клеточной смерти 1, также называемый PD-1) с рецепторами PD-1 и B7.1, находящимися на Т-лимфоцитах, происходит угнетение цитотоксической активности Т-лимфоцитов. Такое угнетение происходит посредством ингибирования пролиферации T-лимфоцитов и продукции цитокинов. Анти-PD-L1-антитело непосредственно связывается с PD-L1 и блокирует его взаимодействие с рецепторами PD-1 и B7.1. Так прекращается опосредованное PD-L1/PD-1-подавление иммунного ответа и развивается реактивация противоопухолевого иммунитета.

На основании понимания механизма PD-1/PD-L1 в развитии опухоли разработано и зарегистрировано в FDA (Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США) 6 различных антагонистов этого процесса. Все они являются моноклональными антителами, способными связываться с PD-1 или PD-L1, демонстрирующими заметный, устойчивый, персистирующий ответ опухоли на лечение. Некоторые пациенты живут без признаков заболевания в течение многих лет [16, 17]. Моноклональное антитело связывается с белком на поверхности опухолевых и антигенпрезентирующих клеток, тем самым блокируя процесс угнетения иммунного ответа. Такой ошеломительный успех привлек большое внимание онкологов, в результате FDA зарегистрировало 3 анти-PD-L1-моноклональных антитела. В целом лечение этими препаратами повышает выживаемость пациентов и увеличивает выраженность объективного ответа опухоли на лечение в исследуемых когортах [18—21]. Отличительной чертой терапии является низкий риск возникновения тяжелых нежелательных побочных явлений (3 степень и более) благодаря таргетному воздействию на PD-L1. Это четко прослеживается при сравнении обычной химио- терапии (например, доцетакселом, где частота таких явлений достигает 54%) и лечения моноклональными антителами, при использовании которых риск возникновения осложнений намного ниже [1, 22, 23]. Не возникает никаких сомнений, что анти-PD-L1/PD-1-терапия будет все чаще входить в рутинную практику, поэтому огромное значение имеет правильная диагностика биомаркеров, обладающих предсказательной ценностью для ответа пациента на терапию. Это позволит не только выбрать пациентов, которые получат пользу от лечения, но и обезопасит тех, кому этот препарат потенциально может нанести вред. Так, G. Planes-Laine и соавт. [24] выделили ряд предсказательных факторов в самой опухоли и ее микроокружении, однако сегодня только статус PD-L1 является тестом, утвержденным FDA и Росздравнадзором.

Тестирование уровня экспрессии PD-L1

Для правильного назначения терапии необходимо определить PD-L1-статус опухоли согласно разработанным рекомендациям производителя препарата. Иммуногистохимический метод позволяет выделить группу пациентов, которые получат максимальную пользу от лечения анти-PD-L1-моноклональными антителами [25]. Тест VENTANA PD-L1 (SP142) был утвержден FDA и другими регуляторными органами в качестве сопроводительной диагностики для пациентов с ТНРМЖ, которым планируется назначение атезолизумаба. Выбор теста VENTANA SP142 и уровень PD-L1-экспрессии определены на основании двойного слепого плацебо-контролируемого исследования третьей фазы IMpassion130, которое показало увеличение общей и безрецидивной выживаемости пациентов с ТНРМЖ, получавших комбинацию наб-паклитаксела с атезолизумабом по сравнению с наб-паклитакселом в монорежиме для пациентов с PD-L1-позитивными опухолями. Для определения PD-L1-статуса ТНРМЖ используется методика подсчета окрашенных иммунных клеток IC [15], разработанная производителем диагностикума. Точкой отсечения принята экспрессия PD-L1 VENTANA SP142 1% и более иммунных клеток. Важно обратить внимание на то, что уровень экспрессии PD-L1 для назначения атезолизумаба отличается в зависимости от показания: для ТНРМЖ достаточно уровня PD-L1 1% и более на иммунокомпетентных клетках. При местно-распространенном или метастатическом уротелиальном раке атезолизумаб может быть назначен при уровне экспрессии PD-L1 5% и более. Подробно информация по методике проведения тестирования и уровню PD-L1 содержится в инструкции к диагностикуму VENTANA SP142 и в инструкции по медицинскому применению препарата, а также в нашей предыдущей статье [26].

Согласно зарегистрированному показанию, применение атезолизумаба возможно в комбинации с наб-паклитакселом у взрослых пациентов с неоперабельным местно-распространенным или метастатическим ТНРМЖ при 1-й линии терапии в комбинации с наб-паклитакселом при наличии экспрессии PD-L1 1% и более на иммунокомпетентных клетках, инфильтрирующих ткань опухоли (рис. 2, 3). Для определения статуса опухоли доступен и одобрен диагностикум VENTANA SP142, регистрационное удостоверение № РЗН 2020/9554 от 21.01.20 [27].

Рис. 2. Реакция с антителами VENTANA PD-L1 SP142, IC 0%, ×20.

Рис. 3. Реакция с антителами VENTANA PD-L1 SP142, IC более 1%, ×20.

Выбор именно диагностикума VENTANA SP142 связан с результатами исследования IMpassion130. В исследовании эффективность комбинации атезолизумаба и наб-паклитаксела изучали как в общей популяции пациентов, так и отдельно в подгруппах в зависимости от PD-L1-статуса. Применение лекарственной комбинации у пациентов с уровнем экспрессии PD-L1 1% и более на иммунокомпетентных клетках дало как клинически значимое увеличение общей выживаемости с 18 до 25 мес (ОР 0,71 [95% ДИ: 0,54, 0,93]), так и значимое увеличение медианы выживаемости без прогрессирования с 5 до 7,5 мес. При этом в популяции пациентов с экспрессией PD-L1 менее 1% не было получено значимого преимущества. Результаты исследования IMpassion130 стали основанием для определения PD-L1-статуса перед назначением атезолизумаба, что позволяет выявить группу пациентов с более высокой вероятностью ответа на терапию. Для терапии ТНРМЖ PD-L1-позитивный статус считается при уровне экспрессии PD-L1 1% и более на иммунных клетках в микроокружении опухоли, что соответствует инструкции по медицинскому применению атезолизумаба [15].

Важно помнить, что для определения PD-L1, помимо VENTANA SP142, существуют другие тесты различных производителей — VENTANA SP263, DAKO 22C3, которые также используются для определения уровня PD-L1-экспрессии. Проведено отдельное исследование, чтобы ответить на вопрос: возможно ли перед назначением атезолизумаба использовать другие PD-L1-тесты, кроме VENTANA SP142? Для ответа на этот вопрос сравнили различные тесты в post-hoc-анализе исследования IMpassion130: были взяты образцы ткани опухоли от 614 пациентов и протестированы на PD-L1 с помощью тестов SP142, SP263, 22C3 (данные были представлены в рамках конгресса ESMO, Rugo et al. Abstract 6571 IMpassion130 PD-L1 IHC). Все исследования проводили в централизованной лаборатории, чтобы минимизировать влияние на результат уровня подготовки патоморфологов. Результаты post-hoc-анализа показали, что доля образцов с PD-L1-позитивным статусом составила 46% для SP142+, 81% — для 22C3+, 75% — для SP263+. При этом тесты SP263 и 22C3 захватывают 98% позитивных результатов по SP142 и определяют как позитивные 55% образцов, которые были SP142-негативные. Далее было проведено сравнение клинической значимости тестов SP142, SP263 и 22C3. Сравнивали выживаемость без прогрессирования (ВБП) и общую выживаемость в PD-L1-позитивной и негативной группе, используя три указанных теста. В группе PD-L1-позитивных пациентов по тесту SP142 наблюдался максимальный прирост общей выживаемости +9,4 месяца. Этот показатель оставался высоким вне зависимости от наличия позитивного результата по SP263 и 22С3: в группах дважды позитивных пациентов по SP142 + SP263 или 22С3 общая выживаемость составила 9,4 и 9,3 месяцев соответственно. Аналогичные результаты были получены для показателя ВБП: более 4 месяцев в группах SP142 вне зависимости от наличия позитивного статуса по SP263 или 22С3. Таким образом, несмотря на то что при использовании тестов с антителами 22C3 Dako и VENTANA SP263 удалось выявить больше пациентов с позитивным PD-L1-статусом, именно группа пациентов с позитивным статусом по PD-L1 VENTANA SP142 получила больше пользы от назначенного лечения. Этот анализ соответствует результатам клинического исследования IMpassion130: в популяции пациентов с метастатическим ТНРМЖ 40% пациентов имеют PD-L1-позитивный статус по SP142 и добавление атезолизумаба в этой группе пациентов сопровождается увеличением выживаемости без прогрессирования до 7,5 мес и клинически значимым увеличением общей выживаемости до 25 мес [28, 29].

Стоит отметить, что при определении PD-L1-статуса может быть выбран как первичный, так и метастатический материал опухоли. В исследовании IMpassion130 для определения PD-L1 первичная ткань опухоли использовалась в 62% случаев и ткань метастазов — в 28%. Увеличение выживаемости без прогрессирования и общей выживаемости ассоциировалось с PD-L1-позитивным статусом вне зависимости от того, был образец первичным или метастатическим [28]. Согласно еще одному исследованию Q. Manson и соавт. [30], пациенты с негативным статусом первичной опухоли и позитивным статусом отдаленного метастаза показали лучшую общую выживаемость (ОР 3,013 [95%, ДИ: 1,201, 7,561; p = 0,019]). Это позволило сделать вывод авторам, что PD-L1-статус первичной опухоли, региональных и отдаленных метастазов может отличаться в 30—50% случаев, а позитивный статус, выявляемый в отдаленных метастазах, является признаком благоприятного прогноза. Исследование иллюстрирует ценность повторной оценки PD-L1-статуса в отдаленных метастазах, что может увеличить пул PD-L1-позитивных пациентов, выигрывающих от назначения онкоиммунологических препаратов.

Материал и методы

С 28 мая 2019 г. по 28 января 2020 г. под эгидой Российского общества клинической онкологии (RUSSCO) на базе кафедры патологической анатомии ФГБОУ ДПО РМАНПО Минздрава России была проведена работа по оценке PD-L1-статуса у пациентов с ТНРМЖ, образцы которого были собраны из различных регионов России.

По дизайну научного исследования лечащий врач мог зарегистрировать пациента в базе данных на сайте cancergenome.ru и отправить гистологический материал при помощи курьерской службы в лабораторию. В посылке должно было содержаться направление на гистологическое исследование, один блок с опухолью и стекло с окрашиванием гематоксилином и эозином, изготовленное с посылаемого блока. По результатам исследования информация о статусе опухоли, уровне экспрессии PD-L1 в опухолевых и иммунных клетках вносилась в базу данных сотрудниками лаборатории и становилась доступной для лечащего врача. Для включения в исследование пациентке необходимо было подписать информированное согласие.

За 7 мес в лабораторию поступил материал 62 пациенток из различных онкологических лечебных учреждений России. В 2 случаях отсутствовали препараты с рутинным окрашиванием, а в 15 случаях были присланы все материалы гистологического исследования, включая окружающую ткань и все лимфатические узлы. В этих случаях исследование занимало больше времени из-за необходимости изготовления новых препаратов и отбора материала. Отсутствие препаратов рутинной диагностики также повышало риск невозможности исследования из-за малого количества материала в блоке. Четыре случая были исключены из исследования в связи с отсутствием опухолевого материала в блоке. В двух случаях реакции были оценены на минимально допустимом количестве клеток.

Все исследования выполняли на предметных стеклах с высокоадгезивным покрытием, готовые срезы сушили в течение ночи в термостате при температуре 37^оС. Иммуногистохимическую реакцию проводили в автоматическом стейнере закрытого типа Ventana Bench Mark Ultra по закрытому протоколу с кроличьими моноклональными антителами Ventana PD-L1 SP142 и системой детекции Opti View DAB IHC Detection Kit с набором для амплификации сигнала Opti View Amplification Kit.

Оценку проводили 3 специалиста, прошедшие соответствующее обучение, в заключение выносили консенсусное мнение.

Результаты

В исследовании приняли участие 58 пациентов в возрасте от 30 до 73 лет (медиана 45,5 года). В процессе исследования 22 (37,93%) из 58 случаев имели позитивный PD-L1-статус по методике определения IC—IC равно или более 1% окрашенных иммунных клеток (рис. 4). Медиана уровня экспрессии лиганда клеточной гибели составила 4%, а интерквартильное расстояние включало показатели от 1,25 до 10%. Распределение уровней экспрессии показано на рис. 5. Также при оценке препаратов определяли уровень экспрессии этого маркера и в опухолевых клетках. Эпителиальные клетки с позитивным окрашиванием были обнаружены лишь в 3 (5,17%) случаях. Важно отметить, что это явление наблюдалось в случаях с высоким уровнем экспрессии PD-L1 в иммунных клетках (более 10%) (рис. 6).

Рис. 4. Графическое отображение распределения количества позитивно окрашенных лимфоцитов среди PD-L1-позитивных опухолей молочной железы.

Рис. 5. Реакция с антителами VENTANA PD-L1 SP142. TC 0, IC более1%, ×20.

Рис. 6. Реакция с антителами VENTANA PD-L1 SP142. TC более 50%, IC более 10%, ×20.

Необходимо отметить, что в процессе исследования не выявлен материал с грубыми нарушениями фиксации и проводки.

Обсуждение

Проведенное на сравнительно небольшой выборке пациентов исследование показало, что позитивный PD-L1 VENTANA SP142-статус обнаружен у 37 (93%) пациентов с ТНРМЖ. Полученные данные согласуются с результатами регистрационного рандомизированного исследования атезолизумаба IMpassion130 [16].

Определение PD-L1-статуса для опухолей различных локализаций, в том числе и для ТНРМЖ, сталкивается с рядом объективных трудностей. На сегодняшний момент из-за наличия большого количества различных платформ и клонов антител без должной подготовки клиницистам и патологоанатомам трудно разобраться самостоятельно в этом многообразии. Свою лепту вносят различные органоспецифичные системы оценки, индивидуальные для разных клонов. Различаются не только методики оценки и правила подсчета клеток, но и точки отсечения, индивидуальные для различных опухолей. Одним из наиболее значимых факторов, влияющих на постановку правильного диагноза, является уровень подготовленности специалистов. Для этого проводятся многочисленные тренинги и курсы повышения квалификации, на которых подробно разбираются тонкости исследования препаратов с иммуногистохимическим окрашиванием PD-L1, правила оценки контролей, правила интерпретации результатов иммуногистохимического исследования.

В настоящее время из всех чек-поинт-ингибиторов для лечения ТНРМЖ в России зарегистрирован только атезолизумаб для назначения в первой линии терапии при PD-L1-позитивном статусе. Для корректного определения PD-L1-статуса важно учесть три основных момента [25, 28, 29]:

1) рекомендовано использовать тест VENTANA SP142 как единственный, позволяющий подобрать пациентов с высокой вероятностью ответа на терапию атезолизумабом;

2) позитивный статус PD-L1 отличается в зависимости от показаний и результатов клинических исследований. Для назначения атезолизумаба в ТНРМЖ достаточный уровень экспрессии PD-L1 ― 1% и более.

3) определение PD-L1-экспрессии у пациентов с ТНРМЖ необходимо проводить на иммунокомпентных клетках (IC).

Методика определения PD-L1 на иммунных клетках тестом SP142 обладает высокой воспроизводимостью (95,8% (ДИ 91,3―98,0%)) [31]. На кафедре патологической анатомии РМАНПО было проведено два тренинга по выполнению этого анализа. По нашим данным, все участники (36 человек) к концу занятий правильно определяют статус опухоли (негативный или позитивный) как минимум в 18 из 20 случаев. Просмотр большого количества изображений помогает не только разобраться в методике оценки, но и научиться определять статус в сложных случаях с пограничными значениями.

Заключение

Онкоиммунологические препараты, такие как атезолизумаб, все шире используются в клинической практике. Атезолизумаб уже сегодня зарегистрирован для терапии уротелиального рака, рака легкого, тройного негативного рака молочной железы. Основной вопрос заключается в правильном выборе профиля конкретного пациента, который может получить максимальную пользу от назначенного лечения иммунным препаратом. Персонализация в отношении PD-L1-диагностики и последующего комбинированного лечения продиктована различной чувствительностью пациентов и возможной резистентностью к иммунотерапии. Наиболее актуален такой подход в терапии метастатического ТНРМЖ ― агрессивного заболевания с плохим прогнозом. Первым онкологическим иммунным препаратом для лечения ТНРМЖ в первой линии является атезолизумаб ― анти-PD-L1-антитело. Атезолизумаб в клинических исследованиях продемонстрировал клинически значимое увеличение общей выживаемости до 25 мес при добавлении к наб-паклитакселу. Для назначения атезолизумаба у пациентов с ТНРМЖ необходимо определять PD-L1-позитивность статуса ― уровень экспрессии PD-L1 1% и более на иммунных клетках по тесту VENTANA SP142. Важно отметить, что использование другого теста, или другого порогового значения экспрессии, или оценка по опухолевым клеткам приводит к ошибкам в диагностике и снижает вероятность правильного назначения атезолизумаба пациентам с метастатическим ТНРМЖ [1, 28].

Для корректного определения маркеров опухоли необходимо не только специальное оборудование и расходные материалы. Решающее значение имеет также квалификация специалистов. Обучение практикующих патологоанатомов новым методам диагностики создает возможности для правильного определения свойств опухолей при применении иммунотерапевтических методов лечения. Национальная программа Российского общества клинической онкологии «Совершенствование молекулярно-генетической диагностики в Российской Федерации с целью повышения эффективности противоопухолевого лечения» на сегодняшний день предоставляет возможность получить высококвалифицированную медицинскую помощь всем пациенткам вне зависимости от места проживания.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Г.А.Ф., С.А.Т., В.В.К.

Сбор и обработка информации — О.А.К.

ИГХ-исследование — О.А.К., Л.Э.З., Ю.Ю.А.

Написание текста — О.А.К., Л.В.М., Ю.Ю.А.

Редактирование — Г.А.Ф., Л.Э.З., Ю.Ю.А., С.А.Т., В.В.К.

Исследование проведено при поддержке АО «Рош-Москва»