Цинзерлинг В.А.

ФГБУ "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии"; Медицинский факультет Санкт-Петербургского университета

Агапов М.М.

Санкт-Петербургскогий государственный университет, Санкт-Петербург, Россия

Орлов А.Н.

Санкт-Петербургский НИИ фтизиопульмонологии

Информативность различных методов идентификации кислотоустойчивых микобактерий в зависимости от степени активности туберкулезного процесса

Журнал: Архив патологии. 2018;80(3): 40-45

Просмотров : 26

Загрузок :

Как цитировать

Цинзерлинг В. А., Агапов М. М., Орлов А. Н. Информативность различных методов идентификации кислотоустойчивых микобактерий в зависимости от степени активности туберкулезного процесса. Архив патологии. 2018;80(3):40-45. https://doi.org/10.17116/patol201880340-45

Авторы:

Цинзерлинг В.А.

ФГБУ "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии"; Медицинский факультет Санкт-Петербургского университета

Все авторы (3)

Морфологические методы выявления микобактерий туберкулеза (МБТ) незаменимы в рутинной практике фтизиатрических, инфекционных и многопрофильных стационаров, дополняя клинические, радиологические, микробиологические и иммунологические подходы. При этом число микобактерий, обычно оцениваемое по количеству кислотоустойчивых палочек при окраске по Цилю—Нильсену (Ziehl—Neelsen), часто не соответствует активности инфекционного процесса как по клиническим, так и морфологическим данным, что, однако, не послужило пока предметом масштабных исследований [1, 2].

Основным, используемым с конца XIX века, методом окрашивания микобактерий является метод Циля—Нильсена с использованием карболового фуксина. Состав красителя и протокол окрашивания варьируют в модификациях разных авторов, но суть метода неизменна: карболовый фуксин задерживается в клеточной стенке микобактерий и сохраняется в ней даже после обработки кислотой, обесцвечивающей все остальные структуры и микроорганизмы.

Альтернативным методом селективного окрашивания МБТ является использование раствора аурамина О и родамина В, предполагающее исследование ткани с применением люминесцентной микроскопии, что ограничивает его широкое использование. Как и карболовый фуксин, аурамин образует комплекс с миколовыми кислотами в составе микобактерий, но, по-видимому, обладает к ним большим сродством, поэтому правильно окрашенные препараты с полноценно обесцвеченным фоном обеспечивают высокую контрастность микобактерий и позволяют обнаруживать их в большем количестве по сравнению с окраской по Цилю—Нильсену [3, 4].

Обсуждается возможность выявления МБТ в тканях при использовании иммуногистохимии (ИГХ) и метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Применительно к ИГХ проблемой является перекрестная чувствительность антител как к микобактериям туберкулезного комплекса, так и к нетуберкулезным микобактериям. Применение метода ПЦР существенно ограничивают значительные технические трудности, связанные с его проведением, а также отсутствие возможности достоверного определения количества возбудителей и их локализации [5—8].

В качестве сыворотки для ИГХ-исследования используются моноклональные антитела к антигену РАВ (Protein antigen B)—гликопротеину с молекулярной массой 38 кДа, обнаруживаемому вне зависимости от состояния клеточной стенки микобактерий [9].

Неоднородность результатов даже при правильно выполненной классической окраске по Цилю—Нильсену может рассматриваться как повод для изучения свойств возбудителя.

Одним из важных факторов, влияющих на взаимодействие МБТ с макроорганизмом, является иммуносупрессия прежде всего при ВИЧ-инфекции, в результате чего морфологическая картина туберкулеза в большинстве случаев становится нетипичной за счет меньшей выраженности гранулематозной реакции и большей альтерации, при этом число обнаруживаемых кислотоустойчивых палочек, как правило, больше [10]. Тем не менее и у пациентов без иммуносупрессии регулярно встречается ситуация, при которой ожидаемая с учетом клинических данных морфологическая картина далека от классических представлений о строении туберкулезной гранулемы, локализации и форме кислотоустойчивых микобактерий [11—14].

Слабое окрашивание карболовым фуксином или полное отсутствие такового, зачастую безосновательно трактуемое как технологический дефект, в действительности может быть связано с изменением самого возбудителя, предполагающим полную или частичную утрату микобактериями клеточной стенки (возможно, по типу образования L-форм), чей химический состав и пространственная структура определяют их тинкториальные свойства. Трансформация в L-формы является универсальным свойством многих видов бактерий, обеспечивающих адаптацию в неблагоприятных условиях [15]. В случае с МБТ в качестве неблагоприятных условий можно рассматривать как иммунный ответ, так и специфическую терапию. Показано, что потеря клеточной стенки может быть одним из факторов формирования лекарственной устойчивости к противотуберкулезным препаратам [16, 17].

Кроме непостоянства тинкториальных свойств микобактерий, также требует изучения феномен, при котором обнаруживаются атипичные формы возбудителя: кокковидные, булавовидные, ветвящиеся и прочие, отличные от классических палочек Коха [18].

Образование подобных форм может происходить как в процессе изменения структуры клеточной стенки, так и в результате изменения жизненного цикла причем и при ускорении размножения, и при его угнетении с преобладанием старых форм. В любом случае атипичная морфология микобактерий требует сопоставления с клиническими проявлениями заболевания и эффективностью терапии [19—22].

Материал и методы

Изучены 24 случая аутопсии клинически, рентгенологически и микробиологически верифицированного фиброзно-кавернозного туберкулеза легких. Большинство пациентов мужчины, средний возраст 49,67±5,77 года. У большей части пациентов зафиксирована широкая лекарственная устойчивость (ШЛУ) МБТ — 14 случаев либо множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) МБТ — 5 случаев (невосприимчивость заболевания соответственно к четырем или двум противотуберкулезным препаратам первой линии), при этом ни в одном случае не выявлено сочетания туберкулеза с ВИЧ. Во всех наблюдениях имело место длительное течение заболевания и продолжительное лечение в профильных стационарах (см. таблицу).

Характеристика исследованных умерших Примечание. М — мужчины, Ж — женщины.

Непосредственной причиной смерти большинства пациентов стала интоксикация вследствие прогрессирования инфекционного процесса, также были зафиксированы случаи смерти от легочного кровотечения, тромбоэмболии легочной артерии и сердечно-легочной недостаточности. На вскрытии диагноз фиброзно-кавернозного туберкулеза во всех случаях подтвержден.

Кусочки легких для гистологического исследования фиксировали в 10% нейтральном формалине с последующей проводкой в спиртах и заливкой в парафин по общепринятым методикам. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином, карболовым фуксином по Цилю—Нильсену, аурамин-родамином (с последующим исследованием с помощью люминесцентного микроскопа), также проводили ИГХ-исследование с использованием моноклональных антител к антигену РАВ.

Исследование включало оценку выраженности морфологических изменений в области каверн и активности туберкулезного процесса по классификации Б.М. Ариэля [23], подсчет количества микобактерий при увеличении в 400 раз и количества полей зрения, в которых они визуализируются, определение соотношения между различными морфологическими формами возбудителя (палочковидными, кокковидными и прочими), а также их локализация (внутриклеточно, внеклеточно либо в виде адгезированных на поверхности фагоцитов).

После оценки процентного соотношения различных морфологических форм микобактерий подсчитывали среднее значение для каждой формы, затем вычисляли абсолютную погрешность с доверительной вероятностью p=0,95. Значимость различий между методами исследования оценивали путем вычисления t-критерия Стьюдента и сравнения с критическими значениями.

Результаты

При окраске гематоксилином и эозином во всех наблюдениях выявлены характерные для туберкулеза изменения, соответствующие прогрессированию инфекционного процесса (активность IV—V степени по классификации Б.М. Ариэля): крупные каверны с широкой фиброзной капсулой в стенках каверн и в окружающей легочной ткани, определялись гранулемы и более крупные очаги отсева, представленные округлыми эозинофильными фокусами казеозного некроза с мелкими фрагментами клеточного детрита различного размера, окруженными клеточным валом, представленным лимфоцитами, плазмоцитами и в большей степени макрофагами с эпителиоидно-клеточной трансформацией и тенденцией к слиянию с формированием единичных гигантских многоядерных клеток Лангерганса типичного строения с примесью единичных нейтрофильных гранулоцитов. В других полях зрения отмечали утолщение межальвеолярных перегородок за счет фиброза, дистелектазы, очаговый антракоз, умеренный интерстициальный и альвеолярный отек, паретическое полнокровие сосудов, очаговые диапедезные кровоизлияния. Бронхи малого и среднего размера характеризовались лимфоцитарной инфильтрацией, склерозом, гипертрофией мышечного слоя, очаговой атрофией мерцательного эпителия (рис. 1, 2).

Рис. 2. Стенка каверны у пациента с фиброзно-кавернозным туберкулезом. Окраска гематоксилином и эозином, ×100.
Рис. 1. Типичная картина туберкулезного воспаления. Окраска гематоксилином и эозином, ×100.

При окраске карболовым фуксином по Цилю—Нильсену в патологических очагах обнаруживали единичные скопления внеклеточно расположенных кислотоустойчивых бактерий в среднем менее чем в 10 полях зрения общим числом не более 1000 (рис. 3, 4).

Рис. 3. Типичные кислотоустойчивые внеклеточно расположенные палочки. Окраска по Цилю—Нильсену, ×400.
Рис. 4. Очаговая тенденция к формированию одиночных скоплений палочек. Окраска по Цилю—Нильсену, ×1000.
Подавляющее большинство (85—95%, в среднем 88,13±2,14%) возбудителей имело палочковидную форму, также встречались кокковидные формы (5—13%, в среднем 9,33±1,17%), на прочие морфологические формы вместе взятые приходилось менее 3% наблюдаемых микобактерий .

При окраске аурамин-родамином и последующем исследовании в люминесцентном микроскопе обнаруживали очаговые скопления внеклеточно расположенных микобактерий в 10—50 полях зрения общим числом от 1000 до 10 000, преимущественно палочковидных (50—85%, в среднем 64,38±4,24%), а также кокковидных (10—45%, в среднем 27,29±3,84%), гранул (2—10%, в среднем 6±1,09%), булавовидных (1—5%, в среднем 1,96±0,6%) и ветвящихся (до 1%) форм микобактерий (рис. 5, 6).

Рис. 6. Палочковидные и атипичные формы микобактерий. Окраска аурамин-родамином. Люминесцентная микроскопия, ×1000.
Рис. 5. Внеклеточно расположенные одиночные микобактерии и их скопления. Окраска аурамин-родамином. Люминесцентная микроскопия, ×400.

При ИГХ-исследовании (рис. 7, 8)

Рис. 7. Множественные внеклеточные скопления микобактерий. ИГХ-исследование, ×400.
Рис. 8. Атипичные морфологические формы микобактерий. ИГХ-исследование, ×1000.
обнаруживали множественные скопления внеклеточно расположенных микобактерий более чем в 50 полях зрения общим числом более 10 000, характеризовавшихся большим разнообразием форм: на палочки приходилось 50—70% (в среднем 57,29±2,78%), на кокковидные — 20—39% (в среднем 28,71±2,31%), на гранулы — 5—13% (в среднем 9,04±1,04%), на булавовидные — 1—7% (в среднем 3,71±0,64%) и на ветвящиеся — 1—3% (в среднем 1,25±0,47%).

Обобщая полученные данные, можно сказать, что доля типичных палочек, выявленных посредством классической окраски по Цилю—Нильсену, значимо больше таковой (t=10,4; p≤0,05), выявленной при окраске аурамин-родамином, и еще более значимо (t=18,2; p≤0,05), чем при проведении ИГХ-исследования. Столь же сильно разнятся показатели для атипичных морфологических форм микобактерий, выявленных при окраске по Цилю—Нильсену в минимальном количестве и обнаруженных в большом количестве при флюоресцентном и ИГХ-исследовании.

Обсуждение

Несмотря на типичную картину активного туберкулезного поражения с большим объемом казеозных масс, окраска по Цилю—Нильсену не выявила многочисленных кислотоустойчивых бактерий, подтвердив встречаемый в практике феномен. Принципиально важным при этом является выбор для исследования именно пациентов с фиброзно-кавернозным туберкулезом, чей анамнез предполагал длительное волнообразное течение заболевания и продолжительную терапию, корректировавшуюся в ходе лечения, с учетом ее неэффективности вследствие устойчивости микобактерий к противотуберкулезным препаратам.

Такие случаи можно считать самыми сложными для классического бактериоскопического выявления МБТ ввиду предшествовавшего длительного процесса адаптации возбудителя, что сопровождалось периодами активации и угнетения размножения, а также изменением структуры клеточной стенки с сохранением вирулентности. Именно особенности жизненного цикла могут объяснить присутствие в большом количестве атипичных форм микобактерий, наиболее убедительно выявленных при ИГХ-исследовании.

Важно отметить отсутствие во всех наблюдениях (как при окраске по Цилю—Нильсену, так и при флюоресцентном исследовании) внутриклеточной локализации возбудителя. Микобактерии отсутствовали как в эпителиоидных клетках, макрофагах и в гигантских клетках Лангерганса, так и в нейтрофильных гранулоцитах. Наиболее информативным следует считать ИГХ-исследование, так как, если следовать теории, что явление дормантности возбудителя сопровождается полной или частичной потерей им клеточной стенки для последующей внутриклеточной персистенции, то отсутствие окрашивания внутриклеточно расположенных микобактерий карболовым фуксином по Цилю—Нильсену можно объяснить именно структурными изменениями клеточной стенки. Однако ИГХ-исследование не зависит от состояния и компонентов клеточной стенки, следовательно, обеспечивает выявление микобактерий, находящихся на любом этапе жизненного цикла, в том числе с изменением своих тинкториальных свойств.

В ходе ИГХ-исследования, как и в случае с окраской по Цилю—Нильсену и аурамин-родамином, не выявлено достоверных признаков присутствия возбудителя внутри фагоцитов, что идет вразрез с традиционными взглядами на локализацию микобактерий в туберкулезном очаге, сформированными на основе экспериментальных моделей заболевания у грызунов [24, 25]. В ряде наблюдений зафиксирована адгезия единичных микобактерий на поверхности макрофагов и нейтрофильных гранулоцитов. Не исключено, что подобное расположение способно симулировать внутриклеточную локализацию.

Необходимо отметить, что в обследованной группе у пациентов имелась определенная гетерогенность, связанная с возрастом, варьировавшим в пределах от 31 года до 84 лет, и длительностью заболевания (от 2 до 33 лет), однако морфологическая картина туберкулеза и характеристика микобактерий практически идентичны у всех пациентов вне зависимости от возраста и давности заболевания.

Принципиальным моментом также явилось расположение в ряде случаев скоплений МБТ по периферии очагов казеозного некроза на границе с прилегающим к зоне некроза валом эпителиоидных клеток и фиброзной стенкой каверны. Данная локализация микобактерий может натолкнуть на мысль о формировании ими биопленок, что может быть одним из объяснений возникновения лекарственной устойчивости, хотя этот вопрос и требует специального изучения.

Выводы

1. Проведенное исследование подтвердило, что микобактерии туберкулеза могут выявляться в тканях с помощью различных методов и иметь разную морфологию, при этом наличие даже небольшого числа кислотоустойчивых бактерий при окраске по Цилю—Нильсену является важным диагностическим признаком, но их отсутствие не свидетельствует об отсутствии туберкулеза.

2. При использовании всех бактериоскопических методов на светооптическом уровне на нашем материале внутриклеточных форм возбудителя не обнаружено.

3. Наибольшая доля атипичных морфологических форм микобактерий обнаруживается при флюоресцентном (35,62%) и ИГХ- исследованиях (42,71%), что демонстрирует их более высокую чувствительность, в то время как при окраске по Цилю—Нильсену атипичные микобактерии выявляются в сравнительно небольшом количестве (11,87%).

4. Микробиологическая сущность и клиническое значение морфологического полиморфизма микобактерий требуют дальнейшего изучения. Более того, можно утверждать, что в уточнении нуждается и патогенез туберкулеза.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — В.А.Ц., М.М.А.

Сбор и обработка материала — А.Н.О., М.М.А.

Статистическая обработка — М.М.А.

Написание текста — В.А.Ц., М.М.А.

Редактирование — В.А.Ц.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Цинзерлинг Всеволод Александрович — д-р мед. наук, проф., рук. научного отд.; e-mail: zinserling@yandex.ru;

https://orcid.org/0000-0001-7361-1927

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail