Кушнарев В.А.

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России, Санкт-Петербург, Россия

Артемьева Е.С.

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России, Санкт-Петербург, Россия

Кудайбергенова А.Г.

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России, Санкт-Петербург, Россия

Сравнение цифрового и визуального методов для оценки индекса Ki-67 в инвазивных карциномах молочной железы

Журнал: Архив патологии. 2018;80(2): 38-42

Просмотров : 130

Загрузок : 1

Как цитировать

Кушнарев В. А., Артемьева Е. С., Кудайбергенова А. Г. Сравнение цифрового и визуального методов для оценки индекса Ki-67 в инвазивных карциномах молочной железы. Архив патологии. 2018;80(2):38-42. https://doi.org/10.17116/patol201880238-42

Авторы:

Кушнарев В.А.

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России, Санкт-Петербург, Россия

Все авторы (3)

Для оценки пролиферативной активности опухоли в клинической практике наиболее изученным считается митотический индекс, оцениваемый по гистологическому препарату, и индекс Ki-67 — по иммуногистохимически окрашенному препарату. Эти методы имеют определенные ограничения и если оценка митотического индекса прочно вошла в классификационные диагностические схемы, то при определении индекса Ki-67 неоднократные попытки стандартизировать методические и технологические подходы приводили всегда к выводу о необходимости валидизации методики оценки в спланированных клинических исследованиях и слабой воспроизводимости этого признака в больших исследованиях с достаточным количеством лабораторий-участниц [1].

Поскольку оценка индекса пролиферативной активности (ИПА) по Ki-67 является прогностическим и предиктивным суррогатным маркером опухолей молочной железы, для стандартизации подходов в оценке ИПА по Ki-67 в клиническом ведении пациентов с карциномой молочной железы в марте 2010 г. была создана международная рабочая группа [1]. Целью рабочей группы явилось определение общей стратегии гармонизации на преаналитическом и постаналитическом этапе диагностики и методических подходов к унифицированной оценке ИПА по Ki-67.

Внедрение количественной оценки вместо традиционно принятой полуколичественной системы оценки в баллах (например, Allred) всегда является критическим этапом в применении метода. Внедрение ИПА Ki-67 с обязательной оценкой процентного соотношения позитивно окрашенных клеток в ежедневную практику патолого-анатомического отделения связано с проблемой воспроизводимости количественной оценки ИПА. В качестве суррогатного маркера ИПА используется для разделения ER-позитивного люминального, А (прогностически благоприятного) и В (прогностически неблагоприятного) подтипа карцином молочной железы. Пороговым уровнем разделения ИПА между этими двумя группами считается 14%, где соответственно люминальный тип, А содержит менее 14% Ki-67-позитивных клеток, люминальный тип В — более 14% Ki-67-позитивных клеток [2]. Кроме того, пороговый уровень индекса Ki-67 выше 15% важен для назначения адъювантной химиотерапии при люминальном В, но не люминальном А-подтипе карцином молочной железы.

Ряд профессиональных сообществ, например Европейское общество патологов (European Society of Pathology — ESP), некоторые руководства [8] рекомендуют делать повторную оценку индекса Ki-67 c участием второго экспертного мнения или использовать цифровой анализ гистологических сканов, если ИПА находится в пределах от 10 до 35%, в так называемой серой зоне, по данным разных авторов [9]. Панель экспертов St. Galen [4] рекомендует исследователю при оценке окраски на Ki-67 ориентироваться на медиану ИПА по лаборатории с целью повышения воспроизводимости между исследователями. Следовательно, стандартизация измерения этого показателя независимо от квалификации патолога и уровня морфологической лаборатории необходима в лечебной тактике.

В связи с развитием цифровых методов визуализации в морфологии предлагаются новые методы оценки ИПА с помощью цифрового анализа изображений (ЦАИ) сканов гистологических препаратов. Предполагается, что автоматический анализ индекса Ki-67 является методом, способным заменить визуальную оценку ИПА и улучшить точность и воспроизводимость оценки.

Целью исследования являлось сравнение двух методов исследования ИПА: визуального метода оценки несколькими исследователями и цифрового анализа изображений. Мы не ставили перед собой цель проанализировать распределение ИПА Ki-67 по видам материала или сравнить виды материала между собой.

Материал и методы

Подготовка когорты пациентов

Из 3842 случаев, исследованных в лаборатории патологической анатомии НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова в период с июля по октябрь 2016 г., в 542 (14,2%) случаях проведено стандартное исследование индекса Ki-67. Распределение по формам заболевания было следующим (рис. 1):

Рис. 1. Распределение когорты пациентов, подвергнутых стандартному исследованию индекса Ki-67.
56% молочная железа, 12,8% женская половая система, 12% мягкие ткани, 6% пищеварительная система, 5,2% лимфатическая система, 4,4% дыхательная система, 3,6% метастатические поражения. Материал карциномы молочной железы (56% от числа исследований) выбран как наиболее часто используемый в практике лаборатории для оценки ИПА. Было проанализировано 104 случая инвазивных карцином молочной железы G2—G3, выбранных случайно (табл. 1).
Таблица 1. Характеристика когорты пациентов, подвергнутых анализу

Фиксированный в формалине (24 ч), залитый в парафин материал резецированных карцином и трепанобиопсий молочной железы c инвазивной карциномой подвергался стандартному морфологическому исследованию с оценкой степени гистологической злокачественности. Иммуногистохимическое исследование пролиферативной активности Ki-67 (кроличьи моноклональные антитела, клон 30−9, CONFIRM, «Roche — Ventana») проведено, согласно протоколу (табл. 2)

Таблица 2. Протокол иммуногистохимического исследования
при помощи автоматического стейнера BenchMark ULTRA («Ventana Medical Systems», США).

Полученные препараты оценивали два исследователя онкопатоморфолога независимо друг от друга. Исследователи обладали различным опытом в области оценки ИПА Ki-67. Препараты отсканированы с помощью сканера гистологических препаратов Panoramic III (3D Histech, Венгрия) и получены цифровые изображения. ЦАИ проведен с помощью программного обеспечения 3D Histech QuantCenter (3D Histech, Венгрия) c разметкой 3—10 зон (рис. 2)

Рис. 2. Примеры разметки зон в отсканированных гистологических препаратах (участки, выделенные синими линиями). Иммуногистохимическая окраска на Ki-67, ×10.
независимым исследователем. Общая площадь аннотаций составляла не менее 1 мм2 в каждом оцениваемом препарате. Оценка количества Ki-67-позитивных клеток проведена с использованием расчетного модуля CellQuant (QC).

Статистический анализ

Статистический анализ выполнен с помощью программного обеспечения R-studio, c применением Wilcoxon signed rank test, так как распределение в выборке отличалось от нормального. Показателем согласованности между значениями двух переменных служил коэффициент непараметрической корреляции r Спирмена, где r=1 обозначает максимально сильную положительную линейную взаимосвязь. Внутриклассовый коэффициент корреляции (Intraclass Correlation — ICC) использовали для выявления связи между методами оценки.

В качестве шкалы для обнаружения согласия (табл. 3)

Таблица 3. Значения коэффициентов ICC, PAC для анализа связи между группами
в полученных интервалах применены критерии для каппы Cohen и Fleiss [6]. Коэффициент воспроизводимости (Percent Agreement Coefficient — PAC) рассчитан для определения процента согласия между группами подсчета ИПА Ki-67. Все анализируемые случаи разделили на группы 0—10, 11—35 и 36—100% ИПА, где в качестве внутреннего стандарта сравнения для разделения на группы выступал модуль QC.

Результаты и обсуждение

Медиана ИПА по анализируемому материалу, согласно данным автоматического модуля анализа QC, составила 25,5% (табл. 4, рис.

Таблица 4. Медиана распределения ИПА Ki-67 по способам оценки
3).
Рис. 3. Распределение ИПА Ki-67 в группах анализа.

Распределение ИПА во всех группах было близко к бимодальному. По степени злокачественности (G2—3) ИПА продемонстрировал высокие значения в grade 3 (табл. 5),

Таблица 5. Медианы распределения ИПА Ki-67 по степени злокачественности
особенно в группе 1-го исследователя.

Медианы, полученные в границах 10—35% ИПА, находятся в интервале от 21 до 24%. Медиана серой зоны составила ~24% ИПА, оцененного с помощью цифрового анализа, группа QC (табл. 6).

Таблица 6. Распределение медиан ИПА Ki-67 в зоне 10—35%
Данный интервал представляет четверть от всего количества исследованных случаев (28%).

Уровень согласия между визуальным и цифровым методом анализа достоверно не различался (p>0,001) между группой QC и исследователями, тогда как между 1-м и 2-м исследователем выявлены значительные различия (p<0,001). Внутриклассовый коэффициент ICC между цифровым и визуальным методом анализа показал сильную взаимосвязь со 2-м исследователем, тогда как между исследователем 1-м и 2-м взаимосвязь была средней. Интересно, что коэффициент воспроизводимости PAC демонстрирует взаимосвязь со значениями ICC во всех группах. Коэффициент корреляции Спирмена имеет тенденцию к положительной связи между всеми группами, подвергнутыми анализу, но связь между 1-м и 2-м исследователем была менее выраженная (табл. 7).

Таблица 7. Коэффициенты корреляции и воспроизводимости в зависимости от способа оценки ИПА

При сравнении рекомендованных границ ИПА значения коэффициентов ICC, PAC показали наличие слабой связи при визуальном методе анализа между 1-м и 2-м исследователем в границах серой зоны 10—35% ИПА по сравнению со средней и сильной связью группы QC/1-й исследователь и QC/2-й исследователь соответственно в других пределах (табл. 8).

Таблица 8. Коэффициенты корреляции и воспроизводимости в зависимости от способа оценки ИПА Ki-67

Заключая, хотели бы сказать, что визуальная оценка индекса Ki-67 является воспроизводимым показателем вне пределов серой зоны. Статистическая обработка данных индекса Ki-67, полученного в результате визуальной оценки разными исследователями или автоматического анализа изображений, показала положительную корреляцию (r=0,89—0,92). Распределение ИПА в группе цифрового анализа выявило наличие серой зоны 10—35% ИПА, где существует недостаточная воспроизводимость между исследователями (ICC 0,47). Медиана серой зоны при оценке ИПА в карциномах молочной железы в нашем исследовании составила 24%, что коррелирует со значениями медианы зарубежных публикаций [3, 5, 8].

Значения ICC и PAC в серой зоне демонстрируют слабую связь между исследователями (см. табл. 8), что нередко приводит к диагностическим неточностям, так как порог 14—20% ИПА для разграничения люминального А- и В-подтипа карцином молочной железы находится в пределах серой зоны.

Низкие и даже отрицательные показатели ICC и PAC (см. табл. 8) в пределах от 0 до 10% связаны с большим внутригрупповым разбросом ИПА. Высокие значения коэффициента согласия (PAC) между цифровым анализом изображений и данными 2-го исследователя свидетельствуют о низком межгрупповом разбросе и характеризуют однородность выборки в интервале 0—10% ИПА. Возможно, это связано с более длительным опытом оценки ИПА 2-м исследователем.

В пределах 36—100% ИПА высокое значение PAC, коэффициента корреляции r в группах QC/1-й исследователь и QC/2-й исследователь подтверждает, что межгрупповое распределение ИПА достаточно хорошо соотносится как при визуальной оценке, так и при ЦАИ. В данном интервале полагаем, что цифровой анализ и визуальная оценка сопоставимы. Полученные данные свидетельствуют, что цифровой анализ способен служить одним из способов стандартизации исследования ИПА в предполагаемой границе до 35% и важен для внутрилабораторного контроля.

Анализ данных при помощи каппы воспроизводимости Cohen в модификации Fleiss [6] возможен только при наличии стандартизованного метода оценки ИПА, в качестве которого может выступать ЦАИ. Визуальная оценка с применением количественных методик требует выработки навыков оценки иммуногистохимических окрасок и определения границы стандарта, что считать достаточным уровнем воспроизводимости ИПА.

Мы рассматриваем возможность использования ЦАИ в качестве внешнего контроля и обучения патоморфологов для оценки ИПА. Для этого необходимо создание цифрового архива отсканированных изображений гистологических препаратов, который будет отвечать современным потребностям морфологической диагностики и клинической практики. Вне пределов серой зоны также необходимы цифровые архивы сканированных препаратов для обучения морфологов количественной оценке индекса Ki-67 в карциномах молочной железы. В пределах серой зоны рекомендуется использование ЦАИ из-за недостаточности показателей воспроизводимости и вследствие клинически обоснованной необходимости разделения на суррогатные подгруппы люминальных карцином.

Заключение

Распределение ИПА при цифровом методе анализа подтвердило границы серой зоны от 10 до 35% с медианой 24%. В данных границах наблюдалась недостаточная воспроизводимость между исследователями при визуальном методе анализа. Значения ИПА выше и ниже границы 10—35% показали достаточный уровень воспроизводимости между цифровым и визуальным методом анализа и являются сопоставимыми. На основании полученных результатов можно констатировать, что цифровой анализ изображений является одним из методов контроля воспроизводимости ИПА Ki-67 для исследователей.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: А.Г.К., В.А.Л.

Сбор и обработка материала: В.А.К., А.Г.К., Е.С.А.

Статистическая обработка: В.А.К.

Написание текста: В.А.К.

Редактирование: А.Г.К., В.А.К., Е.С.А.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Кушнарев Владимир Андреевич — врач патолого-анатомического отд-ния; e-mail: kushnarevvladimir1@gmail.com; ORCID: http://orcid.org/0000-0003-4608-9349

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail