Для оценки пролиферативной активности опухоли в клинической практике наиболее изученным считается митотический индекс, оцениваемый по гистологическому препарату, и индекс Ki-67 — по иммуногистохимически окрашенному препарату. Эти методы имеют определенные ограничения и если оценка митотического индекса прочно вошла в классификационные диагностические схемы, то при определении индекса Ki-67 неоднократные попытки стандартизировать методические и технологические подходы приводили всегда к выводу о необходимости валидизации методики оценки в спланированных клинических исследованиях и слабой воспроизводимости этого признака в больших исследованиях с достаточным количеством лабораторий-участниц [1].
Поскольку оценка индекса пролиферативной активности (ИПА) по Ki-67 является прогностическим и предиктивным суррогатным маркером опухолей молочной железы, для стандартизации подходов в оценке ИПА по Ki-67 в клиническом ведении пациентов с карциномой молочной железы в марте 2010 г. была создана международная рабочая группа [1]. Целью рабочей группы явилось определение общей стратегии гармонизации на преаналитическом и постаналитическом этапе диагностики и методических подходов к унифицированной оценке ИПА по Ki-67.
Внедрение количественной оценки вместо традиционно принятой полуколичественной системы оценки в баллах (например, Allred) всегда является критическим этапом в применении метода. Внедрение ИПА Ki-67 с обязательной оценкой процентного соотношения позитивно окрашенных клеток в ежедневную практику патолого-анатомического отделения связано с проблемой воспроизводимости количественной оценки ИПА. В качестве суррогатного маркера ИПА используется для разделения ER-позитивного люминального, А (прогностически благоприятного) и В (прогностически неблагоприятного) подтипа карцином молочной железы. Пороговым уровнем разделения ИПА между этими двумя группами считается 14%, где соответственно люминальный тип, А содержит менее 14% Ki-67-позитивных клеток, люминальный тип В — более 14% Ki-67-позитивных клеток [2]. Кроме того, пороговый уровень индекса Ki-67 выше 15% важен для назначения адъювантной химиотерапии при люминальном В, но не люминальном А-подтипе карцином молочной железы.
Ряд профессиональных сообществ, например Европейское общество патологов (European Society of Pathology — ESP), некоторые руководства [8] рекомендуют делать повторную оценку индекса Ki-67 c участием второго экспертного мнения или использовать цифровой анализ гистологических сканов, если ИПА находится в пределах от 10 до 35%, в так называемой серой зоне, по данным разных авторов [9]. Панель экспертов St. Galen [4] рекомендует исследователю при оценке окраски на Ki-67 ориентироваться на медиану ИПА по лаборатории с целью повышения воспроизводимости между исследователями. Следовательно, стандартизация измерения этого показателя независимо от квалификации патолога и уровня морфологической лаборатории необходима в лечебной тактике.
В связи с развитием цифровых методов визуализации в морфологии предлагаются новые методы оценки ИПА с помощью цифрового анализа изображений (ЦАИ) сканов гистологических препаратов. Предполагается, что автоматический анализ индекса Ki-67 является методом, способным заменить визуальную оценку ИПА и улучшить точность и воспроизводимость оценки.
Целью исследования являлось сравнение двух методов исследования ИПА: визуального метода оценки несколькими исследователями и цифрового анализа изображений. Мы не ставили перед собой цель проанализировать распределение ИПА Ki-67 по видам материала или сравнить виды материала между собой.
Материал и методы
Подготовка когорты пациентов
Из 3842 случаев, исследованных в лаборатории патологической анатомии НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова в период с июля по октябрь 2016 г., в 542 (14,2%) случаях проведено стандартное исследование индекса Ki-67. Распределение по формам заболевания было следующим (рис. 1):
Фиксированный в формалине (24 ч), залитый в парафин материал резецированных карцином и трепанобиопсий молочной железы c инвазивной карциномой подвергался стандартному морфологическому исследованию с оценкой степени гистологической злокачественности. Иммуногистохимическое исследование пролиферативной активности Ki-67 (кроличьи моноклональные антитела, клон 30−9, CONFIRM, «Roche — Ventana») проведено, согласно протоколу (табл. 2)
Полученные препараты оценивали два исследователя онкопатоморфолога независимо друг от друга. Исследователи обладали различным опытом в области оценки ИПА Ki-67. Препараты отсканированы с помощью сканера гистологических препаратов Panoramic III (3D Histech, Венгрия) и получены цифровые изображения. ЦАИ проведен с помощью программного обеспечения 3D Histech QuantCenter (3D Histech, Венгрия) c разметкой 3—10 зон (рис. 2)
Статистический анализ
Статистический анализ выполнен с помощью программного обеспечения R-studio, c применением Wilcoxon signed rank test, так как распределение в выборке отличалось от нормального. Показателем согласованности между значениями двух переменных служил коэффициент непараметрической корреляции r Спирмена, где r=1 обозначает максимально сильную положительную линейную взаимосвязь. Внутриклассовый коэффициент корреляции (Intraclass Correlation — ICC) использовали для выявления связи между методами оценки.
В качестве шкалы для обнаружения согласия (табл. 3)
Результаты и обсуждение
Медиана ИПА по анализируемому материалу, согласно данным автоматического модуля анализа QC, составила 25,5% (табл. 4, рис.
Распределение ИПА во всех группах было близко к бимодальному. По степени злокачественности (G2—3) ИПА продемонстрировал высокие значения в grade 3 (табл. 5),
Медианы, полученные в границах 10—35% ИПА, находятся в интервале от 21 до 24%. Медиана серой зоны составила ~24% ИПА, оцененного с помощью цифрового анализа, группа QC (табл. 6).
Уровень согласия между визуальным и цифровым методом анализа достоверно не различался (p>0,001) между группой QC и исследователями, тогда как между 1-м и 2-м исследователем выявлены значительные различия (p<0,001). Внутриклассовый коэффициент ICC между цифровым и визуальным методом анализа показал сильную взаимосвязь со 2-м исследователем, тогда как между исследователем 1-м и 2-м взаимосвязь была средней. Интересно, что коэффициент воспроизводимости PAC демонстрирует взаимосвязь со значениями ICC во всех группах. Коэффициент корреляции Спирмена имеет тенденцию к положительной связи между всеми группами, подвергнутыми анализу, но связь между 1-м и 2-м исследователем была менее выраженная (табл. 7).
При сравнении рекомендованных границ ИПА значения коэффициентов ICC, PAC показали наличие слабой связи при визуальном методе анализа между 1-м и 2-м исследователем в границах серой зоны 10—35% ИПА по сравнению со средней и сильной связью группы QC/1-й исследователь и QC/2-й исследователь соответственно в других пределах (табл. 8).
Заключая, хотели бы сказать, что визуальная оценка индекса Ki-67 является воспроизводимым показателем вне пределов серой зоны. Статистическая обработка данных индекса Ki-67, полученного в результате визуальной оценки разными исследователями или автоматического анализа изображений, показала положительную корреляцию (r=0,89—0,92). Распределение ИПА в группе цифрового анализа выявило наличие серой зоны 10—35% ИПА, где существует недостаточная воспроизводимость между исследователями (ICC 0,47). Медиана серой зоны при оценке ИПА в карциномах молочной железы в нашем исследовании составила 24%, что коррелирует со значениями медианы зарубежных публикаций [3, 5, 8].
Значения ICC и PAC в серой зоне демонстрируют слабую связь между исследователями (см. табл. 8), что нередко приводит к диагностическим неточностям, так как порог 14—20% ИПА для разграничения люминального А- и В-подтипа карцином молочной железы находится в пределах серой зоны.
Низкие и даже отрицательные показатели ICC и PAC (см. табл. 8) в пределах от 0 до 10% связаны с большим внутригрупповым разбросом ИПА. Высокие значения коэффициента согласия (PAC) между цифровым анализом изображений и данными 2-го исследователя свидетельствуют о низком межгрупповом разбросе и характеризуют однородность выборки в интервале 0—10% ИПА. Возможно, это связано с более длительным опытом оценки ИПА 2-м исследователем.
В пределах 36—100% ИПА высокое значение PAC, коэффициента корреляции r в группах QC/1-й исследователь и QC/2-й исследователь подтверждает, что межгрупповое распределение ИПА достаточно хорошо соотносится как при визуальной оценке, так и при ЦАИ. В данном интервале полагаем, что цифровой анализ и визуальная оценка сопоставимы. Полученные данные свидетельствуют, что цифровой анализ способен служить одним из способов стандартизации исследования ИПА в предполагаемой границе до 35% и важен для внутрилабораторного контроля.
Анализ данных при помощи каппы воспроизводимости Cohen в модификации Fleiss [6] возможен только при наличии стандартизованного метода оценки ИПА, в качестве которого может выступать ЦАИ. Визуальная оценка с применением количественных методик требует выработки навыков оценки иммуногистохимических окрасок и определения границы стандарта, что считать достаточным уровнем воспроизводимости ИПА.
Мы рассматриваем возможность использования ЦАИ в качестве внешнего контроля и обучения патоморфологов для оценки ИПА. Для этого необходимо создание цифрового архива отсканированных изображений гистологических препаратов, который будет отвечать современным потребностям морфологической диагностики и клинической практики. Вне пределов серой зоны также необходимы цифровые архивы сканированных препаратов для обучения морфологов количественной оценке индекса Ki-67 в карциномах молочной железы. В пределах серой зоны рекомендуется использование ЦАИ из-за недостаточности показателей воспроизводимости и вследствие клинически обоснованной необходимости разделения на суррогатные подгруппы люминальных карцином.
Заключение
Распределение ИПА при цифровом методе анализа подтвердило границы серой зоны от 10 до 35% с медианой 24%. В данных границах наблюдалась недостаточная воспроизводимость между исследователями при визуальном методе анализа. Значения ИПА выше и ниже границы 10—35% показали достаточный уровень воспроизводимости между цифровым и визуальным методом анализа и являются сопоставимыми. На основании полученных результатов можно констатировать, что цифровой анализ изображений является одним из методов контроля воспроизводимости ИПА Ki-67 для исследователей.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования: А.Г.К., В.А.Л.
Сбор и обработка материала: В.А.К., А.Г.К., Е.С.А.
Статистическая обработка: В.А.К.
Написание текста: В.А.К.
Редактирование: А.Г.К., В.А.К., Е.С.А.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Сведения об авторах
Кушнарев Владимир Андреевич — врач патолого-анатомического отд-ния; e-mail: kushnarevvladimir1@gmail.com; ORCID: http://orcid.org/0000-0003-4608-9349