Рецептивность эндометрия — это комплекс структурно-функциональных характеристик эндометрия с конкретными пространственными и временны́ми константами, определяющими способность эндометрия к имплантации [1, 2]. Согласно данным Е. Norwitz и соавт. [3], лишь около 50—60% всех зачатий может привести к беременности с достижением срока 20 нед и более. При этом 75% потерь беременностей обусловлено нарушениями имплантации, поэтому их клинически невозможно распознать как беременность. В целом каждая 9-я семейная пара в Европе и США имеет потери беременности, обусловленные нарушениями имплантации [4].

Женщины, страдающие наследственными тромбофилиями (НТ) и синдромом недифференцированной дисплазии соединительной ткани (нДСТ), имеют высокий риск первичного и вторичного бесплодия, а также высокий риск неудачных попыток ЭКО, что было подтверждено в ряде работ и связано с нарушениями рецептивности эндометрия [2, 5, 6].

Дисплазия соединительной ткани (ДСТ) — это полиорганная и полисистемная патология с прогредиентным течением, в основе которой лежат дефекты синтеза или катаболизма компонентов внеклеточного матрикса или регуляторов морфогенеза соединительной ткани [2]. Имеется две основные разновидности ДСТ — дифференцированная (дДСТ) и недифференцированная (нДСТ) формы [7]. Генетически гетерогенная группа заболеваний мультифакториальной природы — нДСТ, в основе которых лежат нарушения синтеза и распада внеклеточного матрикса, возникающие под действием неблагоприятных факторов внешней среды у индивидуумов с определенной генетической предрасположенностью уже в периоде раннего эмбриогенеза или постнатально и характеризующиеся нечеткой клинической картиной [2].

Согласно определению ВОЗ и Международного общества по тромбозу и гемостазу, тромбофилия — необычная наклонность к тромбозу с ранним возрастным началом, отягощенностью семейного анамнеза, степенью тяжести тромбоза, непропорциональной известному причинному фактору и эпизодам рецидивов тромбоза [8]. В клинических рекомендациях Американской коллегии торакальных врачей по антитромботической и тромболитической терапии диагноз тромбофилии устанавливается при наличии не менее одного критерия из следующего списка: дефицит антитромбина III, дефицит протеина С и S, резистентность фактора V к активированному протеину С, мутация фактора V Лейдена, мутация протромбина G20210A, гипергомоцистеинемия, гомозиготное носительство термолабильного варианта метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR), антифосфолипидных антител или волчаночного антикоагулянта, увеличение активности фактора VIII, а также сниженный уровень протеина Z [8, 9].

НТ и нДСТ нередко являются сочетанной патологией, что обусловлено общностью молекулярно-генетических механизмов развития: во-первых, многие гены, обусловливающие развитие нДСТ и НТ, находятся в соседних локусах: гены PAI-1 α₂-цепей коллагена I типа расположены в одном локусе 7q22.1; ген α-цепи коллагена IV типа и гены факторов свертывания VII и X расположены в одном локусе — 13q34; а гены β₃-субъединицы ламинина и фактора свертывания V находятся в соседних локусах 1q31 и 1q22 [10]. Также белок PAI-1 играет важную роль в развитии этих синдромов: с одной стороны, ингибирует фибринолиз, с другой — стимулирует процессы фиброза [11, 12]. Однако до сих пор остаются неясными морфологические и молекулярно-генетические особенности эндометрия, в первую очередь его стромы, влияющие на рецептивность эндометрия у пациенток с НТ и нДСТ.

Целью исследования является изучение морфологических и иммунофенотипических особенностей эндометрия у пациенток с первичным бесплодием на фоне НТ и синдрома нДСТ.

Исследование выполнено на пайпель-биоптатах эндометрия от пациенток (81), разделенных на 4 группы: 1-я группа — 19 пациенток с клиническим диагнозом нДСТ (средний возраст 31,9±4,5 года), 2-я группа — 40 пациенток с клиническим диагнозом НТ (средний возраст 32,6±4,8 года), 3-я группа — 13 пациенток с сочетанием клинических диагнозов нДСТ и НТ (средний возраст 32,3±4,7 года) и 4-я группа, состоящая из 9 пациенток, — группа контроля, здоровые суррогатные матери.

Критерии включения в основные группы: репродуктивный возраст, бесплодие в анамнезе, диагнозы нДСТ либо сочетание этих заболеваний. Критерии исключения: гиперпластические процессы эндометрия, тяжелая сопутствующая патология (ревматические болезни, онкологические заболевания, сахарный диабет). Критерий постановки диагноза нДСТ — набор симптомов, выявляемых при объективном осмотре, в соответствии с рекомендациями Т.И. Кадуриной и соавт. [13]. Диагноз Н.Т. ставился по результатам проведенного ранее генетического исследования на основании клинических рекомендаций Американской коллегии торакальных врачей по антитромботической и тромболитической терапии [8, 9].

От каждой пациентки исследовались пайпель-биоптаты эндометрия, взятые в период «окна имплантации» (6—8-й день после овуляции по данным УЗИ).

Материал фиксировали в 10% нейтральном формалине и заливали в парафин. Приготавливали ступенчатые парафиновые срезы толщиной 4 мкм. Часть срезов окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван Гизону, толуидиновым синим; другую часть использовали для постановки иммунопероксидазных реакций со следующими первичными антителами: к коллагену I (поликлональные кроличьи антитела, 1:500, «GeneTex», США), коллагену III (поликлональные кроличьи антитела, 1:1000, «GeneTex», США), фибронектину (кроличьи антитела, 1:100, «Dako», Дания), ламинину β2γ1 (мышиные моноклональные антитела, 1:200, «GeneTex», США), MMP-2 (поликлональные кроличьи антитела, 1:200, «Abbiotec», США), MMP-9 (поликлональные кроличьи антитела, 1:200, «Abbiotec», США), к рецепторам эстрогена (ER, клон 1D5, «Dako», Дания, готовый к употреблению), к рецепторам прогестерона (PgR, клон 636, «Dako», Дания, готовый к употреблению), к белку PAI-1 (PAI-1, клон H-135, разведение 1:100, «SantaCruz», США), к белку VEGF-A (разведение 1:100, «Abbiotec», США), к белку LIF (разведение 1:100, «Sigma», Швеция).

Депарафинирование срезов осуществляли в растворе Bioclear («Bio-Optica», Италия). Антигенную демаскировку проводили путем инкубации в 10 мМ цитратном буфере; рН 6,0 («Dako», Дания), при автоматическом нагреве буфера до 96 °C, поддержании этой температуры в течение 20 мин. Ставили положительные и отрицательные контроли. Контрастирование ядер осуществляли раствором гематоксилина Майера (ООО «ЭргоПродакшн», Россия) [14].

Морфометрическое исследование проводили с помощью микроскопа Zeiss Axioplan 2 imaging, оборудованного фотокамерой Zeiss AxioCam Hrc, и программного обеспечения AxioVision v.4.6.2.

Оценку площади очагов склероза при окраске по Ван Гизону и экспрессии маркеров коллагена I, III проводили с помощью морфометрического исследования: оценивали площадь экспрессии программным методом с помощью программного обеспечения AxioVision v.4.6.2.

Оценку степени экспрессии маркеров LIF, PAI-1, VEGF, MMP-2, MMP-9, фибронектина, ламинина осуществляли посредством подсчета окрашенных клеток одного типа. Оценку 0 баллов ставили, если окрашенные клетки отсутствовали, 2 балла — от 0 до 20% включительно окрашенных клеток, 4 балла — от 20 до 40%, 6 баллов — более 40% окрашенных клеток. Для каждой из групп рассчитывали средний балл экспрессии маркеров MMP-2, MMP-9, фибронектина, LIF, PAI-1, VEGF, ламинина и стандартное отклонение.

Оценку экспрессии ER, PgR осуществляли с помощью шкалы Histoscore. Также считали стромальный прогестерон-эстрогеновый индекс (СПЭИ) — отношение экспрессии прогестероновых рецепторов к экспрессии эстрогеновых рецепторов в эндометриальной строме по шкале Histoscore.

Статистическое исследование проводили с помощью пакетов программ IBM SPSS Statistics 22 и MS Excel.

При статистическом исследовании сравнивали средние значения различных величин, для чего использовали непараметрические статистические критерии: Манна—Уитни, Краскалла—Уоллеса, поскольку в группах отсутствовало Гауссовское распределение.

Для оценки рецептивности эндометрия морфологическому исследованию подвергали эндометрий в период «окна имплантации». В 4-й группе в 22% случаев обнаружили признаки ранней стадии фазы секреции — в железистом эпителии эндометрия определяется множество базально расположенных вакуолей, при этом апикальный край клеток все еще ровный, строма в структурном отношении имеет сходство с таковой поздней фазы стадии пролиферации. В 78% случаев выявлены изменения эндометрия, характерные для средней стадии фазы секреции — железы извитые с широким просветом, ядра везикулярные, располагались базально, апикальный край клеток неровный с признаками апокринной секреции в просвете желез и образованием пиноподий — микропротрузий диаметром около 6 мкм в апикальной части поверхностного эпителия эндометрия, экспрессирующих на своей поверхности ряд белков, необходимых для адгезии бластоцисты к поверхности эндометрия, а также признаки васкуляризации и отека стромы.

В 1-й группе эндометрий средней стадии секреции был найден в 38% случаев, в остальных 62% — эндометрий стадии ранней секреции.

Во 2-й и 3-й группах в 25 и 37% случаев соответственно были выявлены морфологические признаки стадии пролиферации в эндометрии: железы извитые с митозами, ядра клеток железистого эпителия округлой формы, некоторые с ядрышками, отмечалась тенденция к расположению ядер в базальной части клеток, строма компактная, ядра фибробластоподобных клеток округлой формы, относительно крупные фибробластоподобные клетки располагаются в густой сети ретикулиновых волокон.

При морфологическом исследовании эпителия эндометрия также оценивался процент зрелых пиноподий — булавовидных выростов эпителиоцитов слизистой оболочки матки в поверхностном слое эндометрия. В 1-й группе выявлено в среднем 5% зрелых пиноподий в поверхностном эпителии эндометрия, во 2-й и 3-й — по 1%, в 4-й группе — 13% зрелых пиноподий.

При оценке стромы эндометрия при окраске толуидиновым синим в 1-й и 3-й группах в строме эндометрия выявлены очаги фиолетовой метахромазии — признаки мукоидного набухания. Во 2-й и 3-й группах во всех исследованных случаях выявлены сладж и кровоизлияния в микроциркуляторном русле стромы эндометрия. Микроскопические очаги фибриноидного некроза стромы эндометрия в 1-й группе выявлены в 68% случаев, во 2-й и 3-й группах — во всех исследованных случаях, в группе контроля — лишь в 45% случаев. Очаги склероза, расположенные нередко периваскулярно, выявлены в 25% случаев в 1-й группе, в 53 и 68% случаев во 2-й и 3-й группах соответственно, в группе контроля они выявлены не были. При оценке суммарной площади очагов склероза при окраске пикрофуксином по Ван Гизону в 3-й группе они составляли наибольший процент — в среднем 1,77% от всей площади препарата; в 1-й и 2-й группах он отличался незначительно — 0,85 и 1,05% соответственно, в группе контроля очаги склероза выявлены не были (рис. 1, табл. 1).

На основании морфологического исследования получены следующие результаты: 1) в исследуемых группах, особенно в 3-й, замедлены процессы созревания эндометрия, что выражено в более частом выявлении морфологических стадий ранней секреции и пролиферации в период «окна имплантации»; 2) снижение среднего процента зрелых пиноподий в поверхностном эпителии эндометрия в исследуемых группах, особенно во 2-й и 3-й, по сравнению с группой контроля, что вместе с п. 1 говорит о снижении рецептивности эндометрия; 3) в 1-й и 3-й группах — очаги дезорганизации соединительной ткани (мукоидное набухание) стромы эндометрия при окраске толуидиновым синим; 4) в 1-й и 3-й группах — мелкие очаги фибриноидного некроза стромы и очаги склероза стромы эндометрия; 5) в 3-й группе — очаги склероза наибольших размеров, что подтверждается данными морфометрии — наибольшим соотношением между суммарной площадью очагов склероза стромы и общей площадью препарата.

При иммуногистохимическом исследовании рецептивности эндометрия исследовали экспрессию эстрогеновых и прогестероновых рецепторов, а также изучали соотношение их экспрессии в строме эндометрия. Эстрогеновые рецепторы экспрессировались в ядрах эпителия и стромы эндометрия. Отмечалась различная степень экспрессии этого маркера в ядрах, при этом не выявлено статистически значимых различий в экспрессии между исследуемыми группами. Прогестероновые рецепторы экспрессировались в ядрах эпителия и стромы эндометрия, при этом не выявлено статистически значимых различий в экспрессии между исследуемыми группами. Также отмечалась различная степень экспрессии этого маркера в ядрах.

При анализе средних значений экспрессии эстрогеновых и прогестероновых рецепторов в строме эндометрия выявили, что во 2-й и 3-й группах высокий процент (более 65%) пациенток с ненормальным СПЭИ. В группе пациенток с нДСТ этот процент достигал 55 от всех вошедших в группу женщин.

При исследовании маркера рецептивности LIF выявляли его экспрессию в цитоплазме поверхностного и железистого эпителия эндометрия, в пиноподиях и цитоплазме клеток стромы эндометрия, при этом наиболее важной считалась экспрессия LIF в пиноподиях поверхностного эпителия эндометрия. При анализе экспрессии выявили, что в основных группах существенно снижены показатели экспрессии этого маркера в поверхностном эпителии эндометрия, особенно в 1-й и 3-й группах больных. Также у женщин в основных группах повышалась экспрессия маркера в строме, особенно в 3-й группе.

При исследовании маркера PAI-1, играющего важную роль в механизмах гемостаза и фиброгенеза, отмечали его экспрессию в цитоплазме клеток поверхностного и железистого эпителия, стромы и эндотелия сосудов эндометрия. При анализе экспрессии в основных группах выявили резкое статистически достоверное повышение уровня экспрессии маркера в эпителии, эндотелии сосудов и строме, особенно во 2-й группе пациенток, по сравнению с группой контроля.

При исследовании VEGF отмечали его экспрессию в цитоплазме клеток поверхностного и железистого эпителия, стромы эндотелия сосудов эндометрия. При анализе экспрессии VEGF выявили, что синдром нДСТ сопровождается понижением, а НТ — статистически достоверным повышением экспрессии маркера в эпителии, строме и эндотелии сосудов эндометрия по сравнению с группой контроля.

При исследовании ММП-2 и ММП-9 отмечали их экспрессию в цитоплазме клеток поверхностного и железистого эпителия, стромы, эндотелия сосудов эндометрия. Стромальная экспрессия ММП-2 в исследуемых группах, особенно в 3-й, снижена по сравнению с группой контроля, при этом при оценке экспрессии ММП-9 статистически значимых различий выявлено не было.

При исследовании ламинина отмечали его экспрессию в цитоплазме клеток поверхностного и железистого эпителия, стромы эндотелия сосудов эндометрия. При исследовании фибронектина отмечали его экспрессию в цитоплазме клеток стромы, эндотелия сосудов эндометрия. Выявлено снижение эпителиальной экспрессии ламинина в 1-й и 3-й группах, экспрессия фибронектина была одинаковой во всех исследуемых группах (табл. 2).

При исследовании коллагена I и III типов отмечали их экспрессию в волокнистом компоненте стромы и очагов склероза эндометрия. Выявлено, что экспрессия коллагена I типа в волокнистом компоненте стромы была одинаково низкой во всех четырех группах. В 4-й группе отмечалась выраженная экспрессия коллагена III типа в волокнистом компоненте стромы, при этом в 1-й и 2-й группах она слабее, чем в группе контроля, а в 3-й группе наиболее слабая. Также оценивали соотношение площадей экспрессии коллагенов I и III типов в очагах склероза — во 2-й группе среднее соотношение равно 0,896, в 1-й и 3-й группах — 0,623 и 0,661 соответственно, т. е. содержание коллагена III типа в очагах склероза было наибольшим при нДСТ и сочетании нДСТ + НТ (см. табл. 1, рис. 2).

На основании результатов иммуногистохимического исследования выявлены следующие результаты: 1) в исследуемых группах снижены иммуногистохимические показатели рецептивности эндометрия (СПЭИ, эпителиальная экспрессия LIF); 2) анализ экспрессии PAI-1 и VEGF показал увеличенную вероятность тромбоза и склероза стромы эндометрия в исследуемых группах, при этом в группах с НТ ангиогенез усиливается, а в группах с нДСТ, наоборот, что свидетельствует в свою очередь о снижении трофики стромы эндометрия при нДСТ; 3) анализ экспрессии матриксных металлопротеиназ, фибронектина и ламинина показал, что при нДСТ и НТ замедлены процессы созревания эндометрия и ухудшены условия для имплантации бластоцисты; 4) анализ экспрессии коллагенов I, III типов показал замедление созревания стромы эндометрия в ходе менструального цикла, а также ремоделирования эндометриальной стромы в исследуемых группах.

В результате исследования уточнен морфологический субстрат нарушений эндометрия при нДСТ и Н.Т. Изменения фазы менструального цикла, частота выявления дисциркуляторных расстройств и очагов склероза в строме эндометрия, изменения числа зрелых пиноподий и других морфологических особенностей, влияющих на рецептивность эндометрия, сопоставимы с данными полученными в нашем предыдущем исследовании [15]. Уточнены данные по экспрессии VEGF: в настоящем исследовании несколько изменен состав группы пациенток с диагнозом нДСТ — выше средний балл выраженности признаков нДСТ по Т.И. Кадуриной по сравнению с предыдущим исследованием, поэтому получены более четкие результаты — статистически значимое снижение экспрессии VEGF при нДСТ и ее статистически значимое повышение при Н.Т. Уровень экспрессии VEGF при сочетании патологий сопоставим с контролем, поскольку действия нДСТ и НТ уравновешивают друг друга.

Очаги склероза, по нашему мнению, являются результатом рубцевания мелких очагов некроза. Эти очаги некроза имеют двоякую природу: при нДСТ они являются проявлением процессов дезорганизации соединительной ткани (фибриноидный некроз), в то время как при НТ — следствием микроинфарктов.

На основании данных литературы, предыдущего и настоящего исследований сформирована схема патогенеза нарушений рецептивности эндометрия, представленная на рис. 3.

Синдромы нДСТ и НТ, и особенно их сочетание, могут являться факторами риска развития первичного бесплодия у женщин в результате нарушения рецептивности эндометрия. При синдроме нДСТ существенно замедляются процессы ремоделирования соединительной ткани, что может приводить к усилению процессов склероза эндометриальной стромы, снижению рецептивности эндометрия и бесплодию. Установлено, что наиболее выраженные изменения морфологических и иммунофенотипических характеристик развиваются при нДСТ + Н.Т. Полученные данные могут быть использованы для прогноза и разработки новых методов лечения бесплодия у пациенток с нДСТ + НТ.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: З.А.С., К.Е.А.

Сбор и обработка материала: З.А.С., Д.Т.А., К.Д.Ю., Ф.Н.М.

Статистическая обработка: З.А.С.

Написание текста: З.А.С.

Редактирование: К.Е.А.

Конфликт интересов отсутствует.