Давыдов Д.А.

ГАУЗ КО «Областной клинический центр охраны здоровья шахтеров», Ленинск-Кузнецкий

Авдалян А.М.

Алтайский филиал ФГБУ "Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина" РАМН, Барнаул

Агаджанян В.В.

ГАУЗ КО «Областной клинический центр охраны здоровья шахтеров», Ленинск-Кузнецкий

Лушникова Е.Л.

ФГБУ «НИИ региональной патологии и патоморфологии» СО РАМН, 630117 Новосибирск

Устьянцева И.М.

ГАУЗ КО «Областной клинический центр охраны здоровья шахтеров», Ленинск-Кузнецкий

Морфометрические и молекулярно-биологические особенности ткани головки бедра при различных нозологических формах коксартроза

Журнал: Архив патологии. 2016;78(5): 20-26

Просмотров : 80

Загрузок :

Как цитировать

Давыдов Д. А., Авдалян А. М., Агаджанян В. В., Лушникова Е. Л., Устьянцева И. М. Морфометрические и молекулярно-биологические особенности ткани головки бедра при различных нозологических формах коксартроза. Архив патологии. 2016;78(5):20-26. https://doi.org/10.17116/patol201678520-26

Авторы:

Давыдов Д.А.

ГАУЗ КО «Областной клинический центр охраны здоровья шахтеров», Ленинск-Кузнецкий

Все авторы (5)

Наиболее частой и тяжелой формой остеоартроза является коксартроз. Это заболевание характеризуется дегенеративными и дистрофическими изменениями синовиальной оболочки, суставного хряща и субхондральной кости [1].

Изучение гистопатологических характеристик ткани головки бедра, удаленной при эндопротезировании, представляет интерес как в клинической практике, так и в теоретическом аспекте. Выявление особенностей строения головки бедра при коксартрозе и установление его этиологического фактора могут иметь ключевое значение в снижении риска послеоперационных осложнений, что оптимизирует поиск способов профилактики контралатерального прогрессирования процесса [2].

Несмотря на уже описанные патоморфологические особенности строения головки бедра при коксартрозе, многие аспекты данной проблемы остаются еще не полностью изучены. Изменения в синовиальной оболочке при остеоартрозе описаны относительно в полной мере, но данные, касающиеся морфометрической характеристики хрящевой и костной ткани головки бедра при коксартрозе, ограничены ишемической формой и требуют всестороннего изучения с применением современных методик [3]. Кроме того, практически полностью отсутствует информация о выраженности фиброза и морфометрических особенностях суставной поверхности и костной ткани головки бедра при других нозологических формах коксартроза [4].

Гистопатологические изменения в головке бедра являются проявлением особенностей процессов ремоделирования костной ткани при определенных нозологических формах коксартроза. Такой молекулярно-биологический метод, как иммуногистохимия, позволяет более детально и всесторонне изучить процессы резорбции и синтеза костной ткани [5]. Резорбция костной ткани происходит под действием лизосомального фермента остеокластов тетратрезистентной кислой фосфатазы (TRAcP). Отмечено, что уровень экспрессии TRAcP в остеокластах изменяется как в физиологических условиях, так и под действием лекарственных препаратов при лечении различного рода заболеваний [6, 7]. Определение уровня цитоплазматической экспрессии TRAcP служит классическим методом не только в идентификации остеокластов, но и в оценке их резорбтивной активности [8]. Исследовательские работы, посвященные определению резорбтивной активности остеокластов в костной ткани головки бедра при различных нозологических формах коксартроза, не дают исчерпывающей оценки патогенезу данного процесса [9]. Значимую роль в развитии и прогрессировании коксартроза играет гипоксия, развивающаяся в результате гемодинамических нарушений в костной ткани головки бедра [10]. Доказано, что улучшение оксигенации костной ткани приводит к снижению активности резорбтивных процессов [11]. В свою очередь важнейшим положительным регулятором ангиогенеза является фактор роста эндотелия сосудов (VEGF). Определение уровня цитоплазматической экспрессии VEGF при различных патологических процессах, в том числе и при патологии опорно-двигательного аппарата, является объективным способом оценки ответной реакции клеток на гипоксию [12]. Для оценки такого компенсаторно-приспособительного процесса при гипоксии, как неоваскулогенез, необходимо определять степень васкуляризации ткани. Для выявления сосудов микроциркуляторного гематогенного русла широко применяется маркер эндотелия кровеносных сосудов CD34 [13].

Цель исследования - провести сравнительный анализ морфометрических и молекулярно-биологических характеристик ткани головки бедра при различных нозологических формах коксартроза.

Материал и методы

Объектом морфологического исследования служили 95 головок бедренных костей, удаленных при эндопротезировании тазобедренного сустава у пациентов с клинически выставленным диагнозом коксартроз III-IV стадии, поступавших в отделение травматологии и ортопедии ГАУЗ КО ОКЦОЗШ для эндопротезирования тазобедренного сустава за период с 2014 по 2015 г. Медиана возраста пациентов составила 56 лет (49-64 года). В исследование вошли 51 (53,7%) мужчина и 44 (46,3%) женщины. По нозологическим формам коксартроз распределен следующим образом: диспластический - 34 случая, постишемический (постколлаптоидная стадия асептического некроза головки бедра) - 31 и посттравматический - 30. Распределение материала по группам исследования проводилось в результате оценки анамнеза и данных дополнительных методов исследования (магнитно-резонансная томография и рентгенография тазобедренных суставов).

Гистологический анализ

Материал доставляли в патологоанатомическое отделение из операционной в забуференном 10% нейтральном растворе формалина. В лаборатории проводили макроскопическое описание препарата и забор фрагментов ткани для микроскопического исследования. Из доставленного материала в вертикальном направлении из наиболее нагружаемого участка головки выпиливали фрагмент суставной поверхности и субхондральной костной ткани размером 1,5×1,0×0,5 см. Фиксацию и декальцинацию выпиленных фрагментов проводили в растворе ЭДТА (ООО «ЭргоПродакшн», Россия) согласно инструкции производителя. После декальцинации осуществляли гистологическую проводку материала с дальнейшим заключением его в парафин. Серийные гистологические срезы толщиной 3 мкм готовили на ротационном микротоме с последующей окраской гематоксилином и эозином и гематоксилином и пикрофуксином. Исследование проводили на световом микроскопе (Nicon Ci-S, Китай) с использованием цифровой фотокамеры (Nicon DS-Fi2, Япония).

В специализированном программном обеспечении (NIS-Elements BR 4.30.00) выполняли морфометрические измерения толщины суставной поверхности и костных балок (в мкм), площади костных балок (в мм2), определяли выраженность фиброза в ткани суставной поверхности и в губчатом веществе костной ткани (в баллах). Оценку выраженности фиброза проводили путем определения площади фиброзной ткани в 5 случайных полях зрения на срезах, окрашенных гематоксилином и пикрофуксином, при увеличении микроскопа в 100 раз. Площадь фиброза до 25% соответствовала 1 баллу, от 25 до 49% - 2 баллам, от 50 до 74% - 3 баллам, 75% и более - 4 баллам.

Иммуногистохимический анализ

Для постановки иммуногистохимической реакции использовали высокоадгезивные стекла с положительно заряженной поверхностью (SuperFrost Plus). Все этапы постановки иммуногистохимических реакций проводили в автоматическом режиме на иммуногистостейнере BenchMark XT («Ventana») с соблюдением протокола исследования к каждому антителу. Оценку резорбтивной активности остеокластов осуществляли путем определения уровня цитоплазматической экспрессии тетратрезистентной кислой фосфатазы (средняя оптическая плотность в условных единицах - усл. ед.) выявляемой в результате иммуногистохимической реакции с моноклональным антителом TRAcP (9C5, «CellMerque»). Васкулогенез оценивали путем определения средней площади сосудов c использованием первичного антитела анти-CD34 (QBEnd/10, «Ventana») и уровня цитоплазматической экспрессии VEGF (SP28, «SpringBio») остеобластов и остеокластов (средняя оптическая плотность в условных единицах - усл. ед.).

Статистическая обработка данных

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью прикладного пакета программ Statistica 6.0. [14].

Проверку нормальности распределения данных выполняли с помощью критерия Шапиро-Уилка (W). В случае нормального распределения данных мерой центральной тенденции являлось среднее значение (М), а мерой рассеяния - стандартное отклонение. Если распределение данных в выборке не соответствовало нормальному закону, то мерой центральной тенденции являлась медиана (Ме), а мерой рассеяния - интерквартильный интервал между 25 и 75% данных в выборке. Для выявления различий между группами использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Для сравнения групп с распределением значений, не отличающихся от нормального, использовали параметрический Т-критерий Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р<0,05. Корреляционный анализ в представленном исследовании проводили с использованием двух критериев: коэффициента ранговой корреляции Спирмена и коэффициента ранговой корреляции Кендалла Тау.

Результаты

Гистопатологическая характеристика головки бедра

Гистологическое исследование головки бедра при посттравматическом коксартрозе указывает на мозаичную структуру суставной ткани - участки неизмененного гиалинового хряща чередуются с зонами клеточной диссоциации изогенных групп хондроцитов с признаками кариопикноза, кариорексиса, плазморексиса. В местах разрушения хрящевой пластинки обнаруживается фиброзная ткань (рис. 1, a). В субхондральной костной ткани чередуются очаги отека и фиброза костного мозга различного размера.

Рис. 1. Гистопатологические особенности ткани головки бедра при коксартрозе. а - заместительный фиброз гиалинового хряща суставной поверхности при посттравматическом коксартрозе; б - очаг асептического некроза в костной ткани при постишемическом коксартрозе; в - образование костных балок при постишемическом коксартрозе; г - остеосклероз костной ткани при диспластическом коксартрозе. а - окраска гематоксилином и пикрофуксином; б-г - гематоксилином и эозином; ×100.

Гистологический анализ головок бедренных костей, полученных от больных с постишемическим коксартрозом, указывает на некротические изменения в хрящевой ткани. В субхондральных отделах происходит асептический некроз жировой ткани, костного мозга и костных балок. Очаги некроза представлены гомогенными эозинофильными массами без воспалительной инфильтрации по периферии (см. рис. 1, б). С процессом некроза сочетается новообразование костной ткани (см. рис. 1, в).

При коксартрозе диспластического генеза микроскопически поверхность головки бедренной кости представлена склерозированной утолщенной субхондральной костной пластинкой, имеющей компактное строение и содержащей небольшие островки хрящевой и фиброзной ткани. Межбалочные пространства фиброзированы, трабекулы подлежащей губчатой кости с признаками остеосклероза (см. рис. 1, г).

Морфометрический анализ

Проведенный морфометрический анализ толщины суставной поверхности, толщины и площади костных балок, а также выраженности фиброза суставной поверхности и костной ткани позволил выявить ряд особенностей (табл. 1).

Таблица 1. Морфометрическая характеристика ткани головки бедра, Me (LQ-UQ) Примечание. Статистически достоверные различия (U-критерии Манна-Уитни): * - с выраженностью фиброза суставной поверхности при постишемическом коксартрозе (р<0,0001); ** - с выраженностью фиброза костной ткани при постишемическом коксартрозе (р<0,0001); *** - с толщиной суставной поверхности при постишемическом коксартрозе (р<0,0001); 4* - с толщиной костных балок при постишемическом коксартрозе (р<0,0001); 5* - с площадью костных балок при постишемическом коксартрозе (р<0,0001).

Выраженность фиброза суставной поверхности в группе посттравматического коксартроза составила 3,6 (3-4) балла. Данный показатель практически в 2 раза выше (р<0,0001), чем в группе постишемического коксартроза. Выраженность фиброза костной ткани при диспластическом коксартрозе составила 3,9 (3-4) балла, что практически в 2 раза выше (р<0,0001), чем в группе постишемического коксартроза, где данный показатель составил 2 (2-2) балла. Максимально истончена суставная поверхность головки бедра при диспластическом коксартрозе. Медиана толщины составила 675 (593-728) мкм. Толщина суставной поверхности при постишемическом коксартрозе составила 1559 (1172-1794) мкм, что более чем в 2 раза больше по сравнению с толщиной суставной поверхности при диспластическом коксартрозе (р<0,0001). Толщина костных балок при диспластическом коксартрозе имела максимальные показатели - 258 (242-300) мкм. Данный показатель был значительно ниже (более чем в 1,5 раза) при постишемическом и посттравматическом коксартрозе (р<0,0001 в обоих случаях сравнения). Площадь костных балок при диспластическом коксартрозе составила 1,4 (1,3-1,6) мм2. Данный показатель оказался в 5 раз выше, чем в группе постишемического коксартроза (р<0,0001).

Иммуногистохимический анализ

Проведенная иммуногистохимическим методом оценка уровней цитоплазматической экспрессии VEGF и TRAcP указывает на особенности компенсаторно-приспособительных процессов в костной ткани головки бедра при коксартрозе диспластического, посттравматического и постишемического генеза (табл. 2).

Таблица 2. Экспрессии VEGF и TRAcP в костной ткани головки бедра, Ме (LQ-UQ) Примечание. Статистически достоверные различия (U-критерии Манна-Уитни): * - с уровнем экспрессии VEGF остеобластами при посттравматическом коксартрозе (р=0,03); ** - с уровнем экспрессии VEGF остеокластами при диспластическом коксартрозе (р<0,0001); *** - со средней площадью сосудов при посттравматическом коксартрозе (р=0,001); 4* - с уровнем экспрессии TRAcP остеокластами при диспластическом коксартрозе (р<0,0001); 5* - с количеством остеокластов при диспластическом коксартрозе (р<0,0001).

Максимальный уровень цитоплазматической экспрессии VEGF в остеобластах определялся при диспластическом коксартрозе и составил 0,66 (0,62-0,69) усл. ед. (рис. 2, а). Данный показатель оказался в 1,2 раза выше (p=0,03), чем в группе посттравматического коксартроза, где уровень экспрессии VEGF в остеобластах показал минимальное значение и составил 0,55 (0,5-0,69) усл. ед.

Рис. 2. Иммуногистохимическое окрашивание с антителами анти-VEGF, анти-TRAcP и анти-CD34 костной ткани головки бедра при различных нозологических формах коксартроза. а - экспрессия VEGF остеобластами при диспластическом коксартрозе; б - экспрессия VEGF остеокластами при постишемическом коксартрозе; в - сосуды микроциркуляторного русла (CD34+ окрашенный эндотелий) костной ткани головки бедра при постишемическом коксартрозе; г - экспрессия TRAcP остеокластами при постишемическом коксартрозе; ×100.

При оценке уровня экспрессии VEGF остеокластами получены следующие результаты (см. рис. 2, б). В группе постишемического коксартроза интенсивность экспрессии составила 0,92 (0,63-0,95) усл. ед. Данный показатель практически в 2 раза выше (р<0,0001), чем в группе диспластического коксартроза, где его значение было минимальным и составило 0,48 (0,38-0,53) усл. ед. Площадь сосудов микроциркуляторного русла в группе постишемического коксартроза составила 2759 (2310-6572) мкм2, что практически в 1,8 раз больше (р=0,001), чем в группе посттравматического коксартроза (см. рис. 2, в). Наиболее интенсивная экспрессия TRAcP регистрировалась в остеокластах группы постишемического коксартроза (см. рис. 2, г), где значение оптической плотности TRAcP составило 0,98 (0,97-1,02) усл. ед. Данный показатель практически в 1,2 раза выше, чем в группах диспластического и посттравматического коксартроза (р<0,0001 в обоих случаях сравнения). Статистически достоверных различий уровня экспрессии TRAcP остеокластами при диспластическом и посттравматическом коксартрозе не получено (р=0,62). В группе коксартроза постишемического генеза количество остеокластов составило 11,4 (10-13) и показало максимальный результат. Количество остеокластов в группе диспластического коксартроза оказалось практически в 2 раза ниже по сравнению с постишемическим коксартрозом (р<0,0001).

Корреляционный анализ

Результаты морфометрического и иммуногистохимического исследований позволили провести корреляционный анализ с определением величины коэффициента корреляции (табл. 3).

Таблица 3. Корреляционные особенности Примечание. * - коэффициент ранговой корреляции Спирмена.

В случае диспластического коксартроза выявлена умеренная прямая корреляционная связь между толщиной и площадью костных балок (r=0,451; p=0,007). Экспрессия VEGF остеобластами и остеокластами имела умеренную обратную корреляцию (r=–0,390; p=0,023). Достаточно характерная сильная прямая корреляционная связь определялась между уровнем экспрессии VEGF остеобластами и площадью сосудов (r=0,705; p=0,000003). В группе посттравматического коксартроза выявлена умеренная прямая корреляционная связь между уровнем экспрессии VEGF остеобластами и площадью сосудов (r=0,401; p=0,028). Корреляционный анализ толщины костных балок и их площади при постишемическом коксартрозе показал наличие умеренной прямой связи (r=0,431; p=0,015). Обратная умеренная корреляционная связь выявлена в этой же группе между экспрессией VEGF остеобластами и TRAcP остеокластами (r=–0,507; p=0,004).

Обсуждение

При диспластическом коксартрозе толщина и площадь костных балок имеют максимальные значения: 258 (243-300) мкм и 1,4 (1,3-1,6) мм2 соответственно. Наблюдаемая морфометрическая картина указывает на активно протекающие процессы синтеза костной ткани в головке бедра при данной нозологической форме коксартроза. Кроме того, компенсаторные механизмы в ответ на гипоксию реализуются преимущественно выработкой VEGF остеобластами, где уровень экспрессии составил 0,66 (0,62-0,69) усл. ед. Схожие данные получены и другими исследователями [15, 16]. Сильная прямая корреляционная связь между экспрессией VEGF остеобластами и площадью сосудов (r=0,705; p=0,000003) и умеренная обратная корреляционная связь между экспрессией VEGF остеобластами и остеокластами (r=–0,390; p=0,023) подтверждает данный факт. Низкие показатели экспрессии TRAcP и минимальное количество остеокластов указывают на то, что резорбтивные процессы в костной ткани головки бедра при данной нозологической форме коксартроза менее выражены.

Коксартроз посттравматического генеза характеризуется максимально выраженными фиброзными изменениями суставной поверхности, что составляет 3,6 (3-4) балла. Данная гистопатологическая картина может быть обусловлена как одномоментной тяжелой травмой гиалинового хряща суставной поверхности в анамнезе, так и незначительным по силе, но действующим длительный период времени травмирующим фактором. Показатели экспрессии VEGF остеобластами и остеокластами выражены примерно в равной степени и составляют 0,55 (0,5-0,69) и 0,55 (0,42-0,62) усл. ед. соответственно. Площадь сосудов микроциркуляторного русла костной ткани головки бедра при данной нозологической форме коксартроза оказалась минимальной и составила 1539,5 (1104-4242) мкм2. Наличие прямой корреляционной связи между уровнем экспрессии VEGF остеобластами и площадью сосудов (r=0,401; p=0,028) указывает на тот факт, что ответные на гипоксию механизмы реализуются преимущественно остеобластами. Резорбтивные процессы выражены незначительно, что отражается невысокими уровнем экспрессии TRAcP остеокластами и их количеством. Значительно меньшая толщина костных балок (p<0,0001; по сравнению с диспластическим коксартрозом) может указывать на достаточно медленно протекающие процессы синтеза костной ткани в головке бедра при посттравматическом коксартрозе.

При коксартрозе постишемического генеза толщина суставной поверхности остается максимальной, а выраженность ее фиброза и костной ткани имеют минимальные проявления. Одним из факторов, способствующим развитию фиброза, является гипоксия [17-19]. Гистопатологическая картина фиброзных изменений головки бедра при постишемическом коксартрозе указывает на более интенсивное прогрессирование патологического процесса, чем при других нозологических формах коксартроза, и медленное формирование фиброзной ткани в ответ на гипоксию. Компенсаторно-приспособительные возможности к гипоксии реализуются не только остеобластами, уровень экспрессии VEGF которых составляет 0,64 (0,5-0,68) усл. ед., но и остеокластами, показывающими максимальное значение экспрессии VEGF 0,92 (0,63-0,95) усл. ед. [20]. Такие показатели экспрессии VEGF сопровождаются максимальным значением площади сосудов микроциркуляторного русла, равным 2759 (22310-6572) мкм2. Резорбтивные процессы в костной ткани головки бедра при данной нозологической форме коксартроза имеют максимальные проявления. Экспрессия TRAcP остеокластами составляет 0,98 (0,97-1,02) усл. ед., а их количество равно 11,4 (10-15). Причем такая активность остеокластов подавляет компенсаторные возможности остеобластов к гипоксии, на что указывает наличие умеренной обратной корреляционной связи (r=–0,507; p=0,0035) между уровнем экспрессии VEGF остеобластами и уровнем экспрессии TRAcP остеокластами.

Заключение

Таким образом, проведенный сравнительный анализ морфометрических и молекулярно-биологических характеристик ткани головки бедра при различных нозологических формах коксартроза указывает на ряд специфических особенностей. Для каждой нозологической формы коксартроза выявлены наиболее характерные проявления определенных морфологических и молекулярно-биологических признаков.

Отмечено, что диспластический, посттравматический и постишемический коксартроз характеризуются специфичными особенностями. Данные особенности могут быть использованы в дифференциальной диагностике нозологических форм коксартроза.

При диспластическом коксартрозе преобладают склеротические процессы в субхондральной пластинке, фиброзные изменения костной ткани и истончение суставной поверхности, уровень экспрессии VEGF в остеобластах значительно выше, чем в остеокластах. Уровень экспрессии TRAcP остеокластами при коксартрозе данной нозологической формы имеет минимальное значение. Для посттравматического коксартроза характерна мозаичная структура хрящевой ткани суставной поверхности с преобладанием фиброзных изменений, минимальная экспрессия VEGF остеобластами и остеокластами, а также низкая резорбтивная активность остеокластов, проявляющаяся незначительная значением экспрессии TRAcP. Постишемический коксартроз характеризуется наличием участков асептического некроза, минимальными фиброзными изменениями как суставной поверхности, так и костной ткани. Уровень экспрессии VEGF остеобластами и остеокластами, а также экспрессия TRAcP остеокластами при данной нозологической форме коксартроза имеют максимальные значения.

В настоящее время вопросы патогенеза коксартроза требуют дальнейшего изучения.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Д.А.Д., В.В.А., И.М.У.

Сбор и обработка материала: Д.А.Д., А.М.А.

Статистическая обработка данных: Д.А.Д., А.М.А.

Редактирование: А.М.А., Е.Л.Л.

Конфликт интересов отсутствует.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail