Роль наследственных тромбофилий и синдрома недифференцированной дисплазии соединительной ткани в патогенезе женского бесплодия (клинико-морфологическое исследование)

В литературе широко обсуждается роль наследственных тромбофилий (НТ) и синдрома недифференцированной дисплазии соединительной ткани (нДСТ) в патогенезе бесплодия и невынашивания беременности [1—7].

НТ — гетерогенная группа заболеваний, характеризующаяся склонностью к повышенной свертываемости крови в результате генных мутаций. Эти мутации могут затрагивать гены факторов свертывания крови (мутация фактора V Лейдена, мутация протромбина (F II) G20210A), гены рецепторов тромбоцитов, гены модуляторов активности факторов свертывания (MTHFR C677T, MTHFRA 1298C, тромбомодулин, гипергомоцистеинемия, дефицит антитромбина III, дефицит протеина С, дефицит протеина S, резистентность фактора V к активированному протеину С, TFPI) либо фибринолиза (PAI-1). Кроме того, необходимо принимать во внимание стойкое увеличение концентрации и/или активности факторов свертывания крови: фибриногена, факторов II, VIII, IX или XI, а также образование в крови антифосфолипидных антител, в том числе обладающих свойствами волчаночного антикоагулянта [1—3, 7, 8].

Как известно, тромбофилии оказывают негативное влияние на многие этапы беременности, начиная от имплантации яйцеклетки и заканчивая тромботическими осложнениями III триместра беременности [3]. Патогенез нарушений репродуктивной функции женщин при нДСТ и НТ не изучен. Известно, что при НТ существенно повышен риск неудач экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), а также «замерших» беременностей и выкидышей на ранних сроках гестации [5, 9—11].

Синдром нДСТ — группа генетически гетерогенных и клинически полиморфных патологических состояний, обусловленная нарушением развития соединительной ткани в эмбриональном и постнатальном периодах, характеризующаяся дефектами волокнистых структур и основного вещества соединительной ткани, приводящая к расстройству гомеостаза на тканевом, органном и организменном уровнях в виде различных морфофункциональных нарушений висцеральных и локомоторных органов и прогредиентному течению. Синдром нДСТ связан с рядом генов, часть из которых отвечает за НТ, например PAI-1, ADAMTS13 и др. [5, 6, 8, 12].

Нарушения имплантации яйцеклетки в эндометрий вследствие его патологии и изменения его рецептивности являются, согласно данным литературы, причиной около 75% потерь беременностей [4]. Рецептивность эндометрия — это комплекс структурно-функциональных характеристик эндометрия с конкретными пространственными и временны́ми константами, определяющий способность эндометрия к имплантации [12]. Отмечается ряд морфологических проявлений этого состояния: эндометрий находится в средней стадии фазы секреции (так называемом «окне имплантации»), на поверхностном эпителии эндометрия имеются в достаточном количестве зрелые пиноподии (не менее 30% площади поверхностного эпителия эндометрия), ряд маркеров (LIF, αvβ3-интегрин и др.) экспрессируется на поверхностном эпителии. Экспрессия PAI-1 определяет вероятность развития очагового фиброза стромы, а экспрессия VEGF — уровень неоангиогенеза в строме эндометрия [4, 6, 8]. Вопрос о состоянии эндометрия при нДСТ и НТ остается открытым.

Целью данного исследования является изучение морфологического субстрата нарушений рецептивности эндометрия у женщин с синдромом нДСТ, НТ, при их сочетании, а также роль этих синдромов в патогенезе женского бесплодия.

Исследование выполнено на пайпель-биоптатах эндометрия, полученных от 81 пациентки, которых разделили на 4 группы: 1-я — 19 пациенток с сочетанием клинических диагнозов нДСТ и НТ (средний возраст 32,3±4,7 года), 2-я группа — 40 пациенток с клиническим диагнозом НТ (средний возраст 32,6±4,8 года), 3-я группа — 13 пациенток с клиническим диагнозом нДСТ (средний возраст 31,9±4,5 года) и 4-я группа, состоящая из 9 пациенток, — группа контроля, здоровые суррогатные матери.

Критерии включения в основные группы: репродуктивный возраст, бесплодие в анамнезе, наличие диагноза нДСТ и НТ либо сочетания этих заболеваний. Критерии исключения: наличие гиперпластических процессов эндометрия и тяжелой сопутствующей патологии (ревматические болезни, онкологические заболевания, сахарный диабет). Критерии постановки диагноза нДСТ: соответствующий набор симптомов, выявляемых при объективном осмотре, в соответствии с рекомендациями Т.И. Кадуриной и соавт. [13].

28 пациенткам с тромбофилиями (независимо от наличия нДСТ) по поводу бесплодия был проведен суммарно 81 протокол вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) — инсеминация и ЭКО, из них 73 (90,1%) протокола у 26 (92,9%) пациенток завершились неудачей, 8 (9,9%) — «замершей» беременностью на сроке до 10 нед. В группе нДСТ + НТ протоколы ЭКО завершились неудачей у 9 (90%) из 10 пациенток. В группе НТ протоколы ЭКО завершились неудачей у 17 (94,4%) из 18 пациенток.

У каждой пациентки, отобранной в исследование, брали пайпель-биоптаты эндометрия в период «окна имплантации» (6—8-й день после овуляции по данным УЗИ).

Материал фиксировали в 10% нейтральном формалине и заливали в парафин. Приготавливали серийные парафиновые срезы толщиной 4 мкм. Часть срезов окрашивали гематоксилином и эозином, другую часть использовали для постановки иммуногистохимических реакций со следующими первичными антителами: к рецепторам эстрогена (ER, clone 1D5, «Dako», Дания, ready-to-use), к рецепторам прогестерона (PgR, clone 636, «Dako», Дания, ready-to-use), к белку PAI-1 (PAI-1, cloneH-135, разведение 1:100, «SantaCruz», США), к белку VEGF-A (разведение 1:100, «Abbiotec», США), к белку LIF (разведение 1:100, «Sigma», Швеция).

Депарафинирование срезов осуществляли в растворе Bioclear («Bio-Optica», Италия). Антигенную демаскировку проводили путем инкубации в 10 мМ цитратном буфере, рН 6,0 («Dako», Дания), путем автоматического нагрева буфера до 96 °C, поддерживали эту температуру в течение 20 мин. Ставили положительные и отрицательные контроли. Контрастирование ядер осуществляли раствором гематоксилина Майера (ООО «ЭргоПродакшн», Россия) [14]. Оценку степени экспрессии маркеров PgR, ER в эпителии и строме эндометрия осуществляли посредством шкалы HistoScore. По этой шкале результат реакции рассчитывали как сумму числа (в %) интенсивно окрашенных клеток (a), умноженного на 3, числа (в %) умеренно окрашенных клеток (b), умноженного на 2, и числа (в %) слабо окрашенных клеток ©, умноженного на 1 (HistoScore = 3⋅a + 2⋅b + 1⋅c). Cтромальный прогестерон-эстрогеновый индекс (СПЭИ) — соотношение степени экспрессии прогестероновых рецепторов в строме эндометрия к степени экспрессии эстрогеновых рецепторов в строме эндометрия. За норму принимали СПЭИ в промежутке от 2 до 4 [15]. Оценку степени экспрессии маркеров LIF, PAI-1, VEGF осуществляли посредством подсчета окрашенных клеток одного типа. Оценку «–» (0 баллов) ставили, если окрашенные клетки отсутствовали, «1+» (2 балла) — при 20% окрашенных клеток, «2+» (4 балла) — при 20—40% окрашенных клеток, «3+» (6 баллов) — при 40% окрашенных клеток и более. Для каждой из групп рассчитывали средний балл экспрессии маркеров LIF, PAI-1, VEGF и стандартное отклонение.

Статистическую обработку проводили с помощью программы Microsoft Excel. При статистической обработке для оценки достоверности различий средних значений между группами использовали t-критерий Стьюдента (формула для n≤30). Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Для оценки рецептивности эндометрия морфологическому исследованию подвергали эндометрий в период «окна имплантации». В группе пациенток с нДСТ + НТ в 37% случаев выявлены изменения эндометрия, соответствующие поздней стадии фазы пролиферации — железы извитые, с митозами, ядра клеток железистого эпителия округлой формы, некоторые с ядрышками, отмечалась тенденция к расположению ядер в базальной части клеток, строма компактная, ядра фибробластоподобных клеток округлой формы, относительно крупные, фибробластоподобные клетки располагаются в густой сети ретикулиновых волокон. В 47% случаев выявлены изменения эндометрия, характерные для ранней стадии фазы секреции — в железистом эпителии эндометрия определяется множество базально-расположенных вакуолей, при этом апикальный край клеток все еще ровный, строма в структурном отношении имеет сходство с таковой поздней фазы стадии пролиферации; в 16% случаев выявлены изменения, характерные для средней стадии фазы секреции (табл. 1). В группе пациенток с НТ в 25% случаев выявлены изменения эндометрия, соответствующие поздней стадии фазы пролиферации; в 36% случаев выявлены изменения эндометрия, характерные для ранней стадии фазы секреции, в 39% — изменения, характерные для средней стадии фазы секреции. В группе пациенток с нДСТ в 38% случаев установлены изменения эндометрия, характерные для ранней стадии фазы секреции, в 62% — изменения, характерные для средней стадии фазы секреции: железы извитые с широким просветом, ядра везикулярные, располагались базально, апикальный край клеток неровный с признаками апокринной секреции в просвет желез, с образованием пиноподий — микропротрузий диаметром около 6 мкм в апикальной части поверхностного эпителия эндометрия, экспрессирующих на своей поверхности ряд белков, необходимых для адгезии бластоцисты к поверхности эндометрия, а также признаки васкуляризации и отека стромы.

В группе контроля в 22% случаев обнаружены признаки ранней стадии фазы секреции. В 78% случаев выявлены изменения эндометрия, характерные для средней стадии фазы секреции.

В основных группах у 60 (83,1%) женщин в период «окна имплантации» выявлен эндометрий с признаками нарушения созревания — секреторные изменения эндометрия отставали от фазы менструального цикла по данным УЗИ, что наиболее выражено в группах больных с нДСТ + НТ и НТ (см. табл. 1). При этом в исследуемых группах наблюдали нарушение формирования пиноподий в поверхностном эпителии эндометрия (рис. 1, 2).

В группе пациенток с нДСТ + НТ отсутствие зрелых пиноподий выявили у 87,2% пациенток, а в группе с НТ — у 80,6% (см. рис. 2). В группах с нДСТ + НТ и НТ часто обнаруживали очаговый склероз, расстройства микроциркуляции (кровоизлияния в строме, сладж и тромбы в микрососудах), очаги дезорганизации в строме, мелкие очажки некроза стромы эндометрия (микроинфаркты) и новообразованные сосуды. В группе с нДСТ очаги дезорганизации, склероз и новообразованные сосуды выявлены в 64% случаев. Распределение по группам показано в табл. 2.

При иммуногистохимическом исследовании рецептивности эндометрия исследовали экспрессию эстрогеновых и прогестероновых рецепторов, а также изучали соотношение их экспрессии в строме эндометрия. Эстрогеновые рецепторы экспрессировались в ядрах эпителия и стромы эндометрия. Отмечалась различная степень экспрессии этого маркера в ядрах, при этом не было выявлено статистически значимых различий в экспрессии между исследуемыми группами. Прогестероновые рецепторы экспрессировались в ядрах эпителия и стромы эндометрия, при этом не было выявлено статистически значимых различий в экспрессии между исследуемыми группами. Также отмечалась различная степень экспрессии этого маркера в ядрах.

При анализе средних значений экспрессии эстрогеновых и прогестероновых рецепторов в строме эндометрия выявили, что в группах женщин с нДСТ + НТ и НТ было высокое (свыше 65%) количество пациенток с ненормальным СПЭИ. В группе пациенток с нДСТ это значение достигало 55% (рис. 3).

Исследование маркера рецептивности LIF выявляло его экспрессию в цитоплазме поверхностного и железистого эпителия эндометрия, в пиноподиях и цитоплазме клеток стромы эндометрия, при этом наиболее важной считалась экспрессия LIF в пиноподиях поверхностного эпителия эндометрия. При анализе экспрессии выявили, что в основных группах были существенно снижены показатели экспрессии этого маркера в поверхностном эпителии эндометрия, особенно в группах больных с нДСТ + НТ и нДСТ. У женщин в основных группах также повышалась экспрессия маркера в строме, особенно в группе нДСТ + НТ (табл. 3, см. рис. 2).

Изучение маркера PAI-1, играющего важную роль в механизмах гемостаза и фиброгенеза, выявило его экспрессию в цитоплазме клеток поверхностного и железистого эпителия, стромы и эндотелия сосудов эндометрия. При анализе экспрессии в основных группах обнаружили резкое статистически достоверное повышение уровня экспрессии маркера в эпителии, эндотелии сосудов и строме, особенно в группе пациенток с НТ, по сравнению с группой контроля (табл. 4, рис. 4).

При исследовании VEGF отметили его экспрессию в цитоплазме клеток поверхностного и железистого эпителия, в строме и эндотелии сосудов эндометрия. Анализ экспрессии VEGF выявил, что синдром нДСТ сопровождается понижением, а НТ — статистически достоверным повышением экспрессии маркера в эпителии, строме и эндотелии сосудов эндометрия по сравнению с группой контроля (табл. 5, рис. 5).

В данном исследовании установлен морфологический субстрат нарушений рецептивности эндометрия при НТ и нДСТ. При нДСТ + НТ и НТ выявлены признаки отставания процессов созревания эндометрия: в этих группах фаза менструального цикла не соответствовала морфологическим изменениям в эндометрии. При этом существенно чаще встречались очаговый склероз стромы эндометрия и расстройства микроциркуляции: очаговые кровоизлияния в строме, сладж и тромбоз в микрососудах. Кроме того, при нДСТ + НТ средний процент зрелых пиноподий на поверхности эндометрия был существенно ниже.

Нарушенная рецептивность эндометрия в группах с нДСТ, НТ и их сочетанием проявлялась частым отклонением СПЭИ от нормальных значений. Также в группах пациенток с нДСТ + НТ и НТ отмечены перераспределение экспрессии LIF из эпителия в строму, а также более выраженная экспрессия PAI-1 и VEGF в эпителии и строме. В группе с НТ выявлена более высокая экспрессия VEGF в эндотелии по сравнению с группой контроля и нДСТ.

На основании полученных данных может быть сформулирована гипотеза развития нарушений рецептивности эндометрия при сочетании синдромов нДСТ + Н.Т. Сами по себе эти синдромы могут неблагоприятно сказываться на состоянии эндометрия, а тем более их сочетание.

В патогенезе нарушений рецептивности эндометрия одну из основных ролей играют наследственные тромбофилии. Многочисленные тромбозы микроциркуляторного русла эндометрия, несмотря на усиленный ангиогенез, проявляющийся увеличением количества новообразованных сосудов, а также повышенной экспрессией VEGF, приводят к развитию множественных микроинфарктов и как следствие очаговому склерозу стромы и нарушению трофики эндометрия, что проявляется, к примеру, замедлением процессов созревания эндометрия: к периоду «окна имплантации» эндометрий приходит в состояние ранней секреции или даже пролиферации с очень незначительным количеством зрелых пиноподий, на которых в недостаточном объеме экспрессируются молекулы, необходимые для адгезии и инвазии бластоцисты (в частности LIF), что в конечном счете приводит к невозможности инвазии бластоцисты и развитию бесплодия [4].

Синдром нДСТ в патогенезе нарушений рецептивности эндометрия играет важную роль. При синдроме нДСТ соединительная ткань не может в полной мере выполнять все свои функции по сравнению с нормой, поэтому в строме эндометрия в процессе репарации после микроинфарктов, обусловленных тромбозом микрососудов, очень часто развиваются очаговые склеротические изменения, а не реституция, что было обнаружено при морфологическом исследовании. При сочетании нДСТ + НТ частота дисциркуляторных расстройств и склероза достоверно выше (p<0,05), чем при НТ без нДСТ. Кроме того, повышенная экспрессия PAI-1, по данным литературы [9], является важным фактором развития склероза (в первую очередь нефросклероза); в нашем исследовании при синдроме нДСТ, сопровождающемся повышенной склонностью к склерозу стромы эндометрия, была повышена экспрессия PAI-1. Также при синдроме нДСТ снижена экспрессия VEGF, что свидетельствует о низком уровне ангиогенеза, проявившемся меньшим количеством новообразованных сосудов и, следовательно, слабом развитии микроциркуляторного русла и хронической гипоксии, что также является важным фактором возникновения склеротических изменений.

При сочетании синдромов нДСТ + НТ резко возрастает количество пациенток с незрелым эндометрием (морфологическая стадия пролиферации или ранней секреции в период «окна имплантации») и соответственно также значительно снижается средний процент зрелых пиноподий. При этом несколько увеличивается доля пациенток с очаговым склерозом, кровоизлияниями в строме и сладжем, тромбами в микрососудах эндометрия. При сочетании нДСТ + НТ выявлено наиболее выраженное перераспределение экспрессии LIF в сторону стромы, притом что имплантация бластоцисты возможна лишь при экспрессии LIF в пиноподиях. Поэтому пациентки с синдромами НТ, нДСТ + НТ входят в группу риска по бесплодию, а проведение ВРТ имеет плохой прогноз в отношении беременности.

Таким образом, формируется порочный круг: тромбофилии усиливают вероятность тромбоза и развития микроинфарктов, а при синдроме нДСТ снижен ангиогенез и затруднено восстановление микроциркуляции после гипоксических повреждений, что в свою очередь еще сильнее усиливает ишемическое повреждение стромы эндометрия при дисциркуляторных расстройствах. Наличие такого порочного круга ведет к относительной ишемии, которая снижает кровоснабжение и трофику, а, следовательно, и функциональную активность эпителия эндометрия, тем самым существенно понижая рецептивность эндометрия и вероятность имплантации яйцеклетки. Это характеризуется уменьшением процента зрелых пиноподий на поверхности эндометрия, нарушением соотношения PgR и ER в строме, снижением экспрессии LIF на поверхности эндометрия и перераспределением его экспрессии в строму.

Синдромы нДСТ и НТ и особенно их сочетание являются факторами риска развития бесплодия у женщин в результате нарушения рецептивности эндометрия. Проявлениями нарушений рецептивности эндометрия являются снижение количества зрелых пиноподий в поверхностном эпителии, очаговый склероз стромы, расстройства микроциркуляции, а также перераспределение экспрессии LIF из поверхностного эпителия в строму, отклонение СПЭИ от нормы, повышение экспрессии PAI-1, VEGF. Установлено, что при сочетании нДСТ + НТ имеются наиболее выраженные нарушения рецептивности эндометрия. Полученные данные могут быть использованы для диагностики, прогнозирования и разработки таргетной терапии бесплодия у женщин с синдромами нДСТ и НТ.

Конфликт интересов отсутствует.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Т.А.Д., Е.А.К., Д.Ю.К.

Сбор и обработка материала: Е.А.К., Д.Ю.К., Н.М.Ф.

Анализ материала: Т.А.Д., Е.А.К.

Статистическая обработка: А.С.З., Т.А.Д.

Написание статьи: Т.А.Д., Е.А.К., А.С.З., Н.М.Ф., Д.Ю.К.