Прогностическое значение маркеров пролиферативной активности и регуляции апоптоза при плоскоклеточном раке гортани

Поиск молекулярно-биологических маркеров, способствующих определению биологических особенностей опухоли, прогнозированию развития метастазов, реакции опухоли на лечение и индивидуального прогноза, остается актуальной проблемой современной онкологии, в том числе и при плоскоклеточном раке гортани [1].

Особое значение в прогнозировании поведения опухоли придают ее пролиферативной активности. Наиболее распространенным маркером пролиферации является антиген Ki-67, который предположительно относят к регуляторным белкам, поскольку его появление совпадает с моментом вступления клетки в митотический цикл [2]. Циклин D1 — протеин массой 45 кДа, кодируемый геном CCND1 (также известным как PRAD1; 11q13), — является решающим для клеток при прохождении чек-поинта G1, известного так же как точка ограничения, и его синтез абсолютно зависим от наличия ростовых факторов во внеклеточном окружении. Повышенная продукция циклина D1 способствует инициации клеточного деления. Ген циклина D1 (ССND1 или PRAD1) амплифицирован в 30—50% случаев рака гортани, его амплификация связана с более агрессивным поведением опухоли [3]. Большинство исследователей считают, что циклин D1 играет роль в развитии плоскоклеточного рака гортани [4—13]. Попытки найти корреляцию экспрессии циклина D1 с прогнозом рака гортани приводят к противоречивым результатам.

Наиболее универсальным молекулярным изменением в различных опухолях человека является инактивация функции белка р53, который кодируется геном-супрессором р53. Ген р53 получил название «страж генома», так как координирует основные процессы поддержания стабильности генома многоклеточного организма [14—17]. Мутации гена р53 обнаруживаются в 50—60% новообразований более чем при 50 различных типах опухолей [18].

Гены семейства BCL-2 являются компонентами внутриклеточных «сверочных точек» апоптотических сигналов, индуцированных различными факторами. р53 регулирует активность белков семейства bcl-2, репрессируя ген антиапоптотического белка bcl-2 [14, 16]. В настоящее время его считают одним из основных ингибиторов апоптоза. Белок bcl-2 может блокировать включение апоптоза и способствовать прогрессированию опухоли [14, 19, 20]. Мутация гена bcl-2 ингибирует апоптоз, что может способствовать развитию опухолей и влиять на их клиническое поведение [20, 21]. Данные о прогностическом значении bcl-2 для опухолей различной локализации противоречивы. Так, этот маркер является фактором плохого прогноза рака пищевода, предстательной железы, переходно-клеточного рака, а для почечно-клеточного этот маркер является фактором благоприятного прогноза [20].

В литературе последних лет именно этим маркерам уделяется большое внимание.

Цель настоящей работы — оценить прогностическое значение экспрессии белков р53 и bcl-2, антигена Ki-67 и циклина D1 при плоскоклеточном раке гортани.

Исследован биопсийный материал, полученный от 64 пациентов (62 мужчины, 2 женщины) в возрасте от 34 до 77 лет (средний возраст 56±1,2 года) с инвазивным плоскоклеточным раком гортани, проходивших комбинированное лечение в ГУ МРНЦ РАМН с 1998 по 2005 г. (срок наблюдения — от 2 до 9 лет после операции). Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином и использовали для иммуногистохимического исследования. Блокирование эндогенной пероксидазы проводили охлажденным 3% раствором H2O2 в течение 10 мин. Для восстановления антигенной структуры клеток фиксированного в формалине и заключенного в парафин материала в течение 20 мин гистологические срезы нагревали на водяной бане в 0,01 М цитратном буферном растворе (рН 6.0) при 95 °С. Инкубацию с первичными антителами Ki-67 и р53 («Dako») проводили при комнатной температуре в течение 60 мин. Для визуализации продуктов иммунной реакции использовали стрептавидин-биотиновый пероксидазный метод («Dako», LSAB+Kit, HRP), в качестве хромогенного субстрата применяли раствор диаминобензидина («Dako», Liquid DAB+), ядра докрашивали гематоксилином. В качестве негативного контроля использовали срезы, на которые наносили вторичные антитела без нанесения первичных.

Степень дифференцировки опухоли и стадию опухолевого процесса оценивали согласно рекомендациям Всемирной организации здравоохранения 2005 г. Положительной экспрессией белка Ki-67 считали наличие специфического окрашивания в коричневый цвет ядер опухолевых клеток, циклина D1 и р53 — специфического ядерного окрашивания более чем в 30 и 25% опухолевых клеток соответственно, положительной экспрессией bcl-2 — специфическое цитоплазматическое окрашивание более чем 30% опухолевых клеток (рис. 1—4).

Индекс Ki-67 и р53 определяли с помощью компьютерного анализатора изображения «Leica QWin» при анализе более 2000 клеток в произвольно взятых полях зрения. Индекс Ki-67 и р53 вычисляли как соотношение площади специфически окрашенных ядер к площади всех ядер и выражали в процентах.

Уровень Ki-67 и р53 сравнивали с клинико-анатомическими параметрами (критерий Т, степень дифференцировки опухоли, наличие регионарных метастазов, развитие рецидива) с использованием дисперсионного анализа, t-тест Стьюдента, таблицы сопряженности 2×2 (χ², точный критерий Фишера). Анализ выживаемости производили с помощью метода Каплана—Мейера (1958), достоверность различий между кривыми выживаемости подтверждали Cox`s F-Test. Значимым принимали уровень р≤0,05. Статистическую обработку полученных данных проводили с применением пакета прикладных программ Statistica 6.0.

На момент исследования Т2 выявлена у 5 пациентов, Т3 — у 37 и Т4 — у 22 больных. Метастазы в регионарных лимфатических узлах диагностированы в 19 наблюдениях. Отдаленных метастазов не выявлено ни в одном случае.

В 11 случаях имел место высокодифференцированный плоскоклеточный рак, в 26 — умереннодифференцированный, и в 27 — низкодифференцированный. Рецидив заболевания развился у 17 пациентов в сроки от 1 до 4 лет, 9 из них умерли от прогрессирования заболевания в сроки от 1 до 4 лет.

Ki-67-позитивные клетки выявляли во всех случаях, минимальное количество составило 7%, максимальное — 100%, медиана — 55%, среднее арифметическое — 54,9±3,0%.

Положительное специфическое окрашивание при реакции с антителами к циклину D1 наблюдалось в 28,1% (18 случаях). В этой группе опухолей среднее значение Ki-67 составило 66,9±22,2%, а в группе опухолей, не экспрессировавших циклин D1, — 50,3±23,1%. Различие между группами статистически достоверно (р=0,01).

С понижением степени дифференцировки опухоли пролиферативная активность, определяемая уровнем Ki-67, увеличивалась (22, 46 и 77%, р<0,01). Средний уровень Ki-67 при увеличении стадии Т также увеличивается (35, 54 и 61%), однако статистически значимые различия получены только между группами Т2 и Т4 (р=0,05). Средний уровень Ki-67 в группе с выявленными метастазами был выше, чем в группе без выявленных метастазов (64 и 51%, р=0,05).

При использовании полуколичественного метода — сравнения групп пациентов, в опухолях которых уровень Ki-67 более (55%) и менее медианы — статистическая достоверность связи между высоким уровнем Ki-67 и наличием метастазов в лимфатических узлах увеличивается (р=0,03), а также выявляется связь с наличием рецидива заболевания (р=0,04). Корреляции между наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах и экспрессией циклина D1 не обнаружено (р=0,66), а связь с развитием рецидива выявлена на уровне тенденции (р=0,08).

В группе пациентов с высокой пролиферативной активностью опухолей 5-летняя безрецидивная и специфическая выживаемость значительно ниже (табл. 1 и 2).

Позитивная реакция ядер опухолевых клеток с антителами к р53 обнаружена в 36 (56,3%) случаях. Распределение уровня р53 в выборке непараметрическое. Не установлено корреляции между уровнем р53 и степенью дифференцировки опухоли (р=0,23), а также стадии Т. Имеется статистически значимая связь экспрессии р53 в опухоли с развитием рецидива заболевания (р=0,01) и наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах на уровне тенденции (р=0,08), а также с 5-летней выживаемостью (см. табл. 1 и 2).

У 22 (34,4%) пациентов наблюдалась коэкспрессия белка р53 и высокого уровня Ki-67. У 10 из них развился рецидив заболевания, 7 погибли от прогрессирования заболевания, о судьбе 3 пациентов нет данных. У 6 пациентов с возникшим рецидивом наблюдалась экспрессия р53 или высокий уровень Ki-67. Только у одного пациента с рецидивом рака экспрессия белка р53 отсутствовала и был низкий уровень пролиферации опухолевых клеток (индекс Ki-67 29%) в первичной опухоли. В дальнейшем больной умер от прогрессирования опухоли. Связь коэкспрессии р53 и высокого уровня Ki-67 с развитием рецидива имеет высокую статистическую значимость (р=0,016).

У 10 из 19 пациентов с метастазами в регионарных лимфатических узлах наблюдалась коэкспрессия р53 и высокого уровня Ki-67. У остальных 9 пациентов с метастазами был высокий уровень Ki-67 или позитивная реакция с р53. В группе пациентов с низкой пролиферативной активностью опухолевых клеток и отсутствием экспрессии белка р53 в опухоли метастазов в регионарных лимфатических узлах не выявлено. Уровень статистической значимости связи коэкспрессии р53 и высокого уровня Ki-67 с наличием метастазов составил 0,04.

Анализ выживаемости в этих группах представлен в табл. 1 и 2.

При сопоставлении экспрессии циклина D1 и р53 значимой зависимости между этими показателями не выявлено (р=0,42).

Экспрессия bcl-2 обнаружена в 19 (29,7%) случаях. Значимой зависимости между экспрессией bcl-2, метастазами в регионарных лимфатических узлах и развитием рецидива болезни не выявлено (р=0,25 и р=0,17 соответственно).

Экспрессия bcl-2 несколько чаще наблюдалась при Т3, чем при Т2 и Т4, а также при умереннодифференцированном раке (G2), однако значимой связи между экспрессией bcl-2 и стадией Т, а также степенью дифференцировки опухоли не выявлено. Пятилетняя выживаемость была значительно выше в группе с bcl-2-позитивными опухолями (см. табл. 1 и 2). Коэкспрессия bcl-2 и р53 выявлена в 14 случаях, а экспрессия bcl-2 и отсутствие экспрессии р53 — в 5, связь между экспрессией маркеров bcl-2 и р53 не достигала уровня статистической значимости (р=0,06). Во всех случаях с экспрессией bcl-2 и без экспрессии р53 в клиническом течении болезни рецидивов не наблюдалось. У 3 из 14 пациентов, опухоли которых экспрессировали оба маркера, развился рецидив заболевания, и один из этих больных умер от прогрессирования опухоли. Однако статистически значение коэкспрессии bcl-2 и р53 для развития рецидива не было достоверным (р=0,16).

Наши результаты частично согласуются с данными других авторов. Большинство исследователей также выявляют корреляцию между уровнем Ki-67 и нарушением дифференцировки опухоли [23—26], наличием метастазов в лимфатических узлах [24, 27]. D. Mielcarek-Kuchta и соавт. [28] указывают на четкую корреляцию между Ki-67 и понижением дифференцировки опухоли, Ki-67 и стадией Т, но не находят ее с наличием метастазов в лимфатических узлах. О. Ataman и соавт. [29] при высоком уровне Ki-67 отмечают длительный период до выявления метастазов, что объясняют выраженным ответом опухоли на терапию. С. Sittel и соавт. [30] показали, что при раке гортани Т1 и Т2 высокий уровень Ki-67 коррелирует с коротким безрецидивным периодом. Поскольку экспрессия Ki-67 значительно выше в опухолях пациентов с неблагоприятным исходом лечения, то сделан вывод об успешном использовании маркера как критерия выбора терапии [30]. M. Acikalin и соавт. [31] обнаружили значительную корреляцию уровня Ki-67 с Т и N, однако не выявили корреляции со степенью дифференцировки опухоли. Авторы показали четкую связь между уровнем Ki-67 и возрастом пациентов, стадией Т, наличием метастазов в лимфатических узлах и рецидивом, причем наиболее важным прогностическим значением рецидива считают уровень Ki-67, превышающий 21% [31]. Наши результаты согласуются с данными T. Arisi и соавт. [32], O. Ataman и соавт. [29], которые также показали, что экспрессия циклина D1 опухолевыми клетками свидетельствует о низкой общей и безрецидивной выживаемости. Y. Dong и соавт. [6] при анализе выживаемости также выявили связь между экспрессией циклина D1 как с общей, так и с безрецидивной выживаемостью. Такие же результаты приводят L. Pignatoro и соавт. [33, 34], указавшие на связь с короткой безрецидивной и общей выживаемостью, а также с развитием рецидива. Об успешном использовании циклина D1 как маркера локо-регионарного рецидива сообщают X. Wong и соавт. [11]. По нашим данным, связь между экспрессией циклина D1 и развитием рецидива имеется только на уровне тенденции (р=0,08). Мы также не обнаружили четкой связи между наличием метастазов в лимфатических узлах и экспрессией циклина D1, что согласуется с данными W. Zhou и соавт. [12].

R. Vielba и соавт. [35] отмечают уменьшение безрецидивного периода и времени выживаемости при р53-позитивном плоскоклеточном раке. H. Izawa и соавт. [23] выявили связь между р53 и наличием метастазов в лимфатических узлах, а также с Т. Данные о биологической и прогностической значимости коэкспрессии Ki-67 и р53 клетками плоскоклеточного рака гортани противоречивы. В большинстве работ показано, что высокий уровень пролиферации опухоли и экспрессия р53 являются независимыми прогностическими маркерами и свидетельствуют о неблагоприятном прогнозе [24—26, 34, 37].

В норме белок р53 регулирует активность белков семейства BCL-2, репрессируя ген антиапоптотического белка bcl-2. Представляется закономерным, что при инактивации р53 активируется bcl-2. Это проявляется экспрессией bcl-2 в опухолевых клетках. Действительно, по нашим данным, экспрессия bcl-2 выше при р53-позитивном раке, что согласуется с результатами, полученными другими авторами [38]. При анализе 5-летней выживаемости нами обнаружено, что при bcl-2-позитивных опухолях специфическая выживаемость выше, чем без экспрессии bcl-2. Эти данные согласуются с результатами многих исследователей, показавших, что экспрессия bcl-2 клетками опухоли является благоприятным прогностическим маркером [29], хотя остается непонятным механизм благоприятного влияния bcl-2 на прогноз заболевания.

Поскольку злокачественная трансформация клеток сопровождается их неконтролируемой пролиферацией и замедлением процесса апоптотической гибели, то следовало бы ожидать, что интенсивная гибель опухолевых клеток ассоциируется с лучшим прогнозом заболевания, и наоборот. Однако так происходит не всегда, что подчеркивает сложность биологических систем и неоднозначность протекающих в них процессов. Так, в ретроспективном исследовании установлено, что показатель 10-летней выживаемости больных с высокими значениями апоптотического индекса клеток рака гортани значительно ниже, чем больных с низкими его значениями (47 и 81% соответственно) [40].

Таким образом, маркеры пролиферативной активности при плоскоклеточном раке гортани являются важными прогностическими факторами. Уровень Ki-67 более 55% является прогностически неблагоприятным признаком, свидетельствующим о высоком риске наличия метастазов в регионарных лимфатических узлах и развития рецидива заболевания после проведенного лечения, низкой 5-летней специфической и безрецидивной выживаемости. Наличие экспрессии циклина D1 в опухоли свидетельствует о низкой 5-летней безрецидивной и специфической выживаемости.

Экспрессия р53 в ядрах клеток плоскоклеточного рака гортани — неблагоприятный прогностический признак. Белок р53 является маркером развития рецидива заболевания и низкого уровня безрецидивной 5-летней выживаемости. bcl-2 является прогностически благоприятным маркером, экспрессия которого связана с высокой специфической выживаемостью.

Коэкспрессия р53 и уровня Ki-67 более 55% является фактором агрессивного поведения опухоли при плоскоклеточном раке гортани, связанным с метастазами в регионарных лимфатических узлах, развитием рецидива и низкой безрецидивной и специфической 5-летней выживаемостью.