Экспрессия Ki-67 и матриксной металлопротеиназы-9 в фолликулярной кисте, кератокистозной одонтогенной опухоли и амелобластоме

Одонтогенные кисты и опухоли занимают ведущее место в челюстно-лицевой хирургии, характеризуются выраженной морфологической и клинической гетерогенностью и связаны с нарушением онтогенеза структур зуба. В настоящее время выделяют фолликулярную кисту, а ортокератозную и паракератозную кератокисты рекомендовано расценивать как варианты кератокистозной одонтогенной опухоли, соответственно, с преобладанием гиперкератоза или паракератоза, что нашло свое отражение в классификации Всемирной организации здравоохранения [1]. Амелобластома представляет эктодермальную опухоль, характеризуется пролиферацией одонтогенного эпителия и составляет около 10% всех опухолей челюстных костей [2]. Несмотря на многообразие отечественных и зарубежных исследований, механизмы, лежащие в основе инвазии одонтогенных новообразований, остаются предметом дискуссий [3—5]. Одним из подобных процессов может являться скорость клеточной пролиферации [5, 6]. Пролиферативная активность оценивается по количеству клеток, вовлеченных в клеточный цикл и, таким образом, представляет внутренний потенциал роста новообразования, который выявляется с помощью ядерного белка Ki-67. Инвазивные свойства опухолей могут быть также связаны с активностью матриксных металлопротеиназ (ММП), представляющих семейство кальций- и цинкзависимых эндопептидаз, способных разрушать разные компоненты внеклеточного матрикса, усиливающие опухолевый рост, инвазию и метастазирование клеток [7, 8]. ММП-9 (желатиназа-В) способна расщеплять коллаген IV и структурные компоненты базальной мембраны и в настоящее время рассматривается как ключевой показатель инвазивных свойств опухолевых клеток [9—11]. Исследования пролиферативной активности и экспрессии ММП-9 одонтогенных кист и опухолей могут раскрыть механизмы агрессивного течения этих новообразований.

Целью настоящего исследования явилась оценка экспрессии белка Ki-67, характеризующего пролиферативную активность клеток, и ММП-9 в фолликулярной кисте, вариантах кератокистозной одонтогенной опухоли (с преобладанием гиперкератоза и паракератоза) и амелобластоме.

В работе использовали операционный материал, полученный в отделении хирургической стоматологии ЦНИИС и ЧЛХ за 2010—2012 гг. Исследовали гистологические препараты 40 пациентов в возрасте от 11 до 62 лет (23 мужчины, 17 женщин) после удаления одонтогенных новообразований (5 фолликулярных кист, 11 кератокистозных одонтогенных опухолей с преобладанием гиперкератоза, 7 кератокистозных одонтогенных опухолей с преобладанием паракератоза, 17 амелобластом разных гистологических вариантов: акантоматозного — 8 случаев, фолликулярного — 5 случаев, плексиформного — 2 случая, гранулярно-клеточного — 1 случай, базальноклеточного — 1 случай).

Иммуногистохимическое (ИГХ) исследование проводили в соответствии со стандартным протоколом. Ткани фиксировали в 10% нейтральном формалине (pH 7,4), после проводки в спиртах заливали в парафин с температурой плавления 54 °С. Для гистологического и ИГХ-исследования серийные срезы толщиной 5 мкм монтировали на стекла, покрытые поли-L-лизином. Тканевые антигены выявляли с помощью моноклональных мышиных антител к белку Ki-67 (MM1, «Diagnostic Biosystems», 1:200) и очищенных антител кроличьей антисыворотки к ММП-9 («Thermoscientific», 1:400). Иммунные комплексы выявляли с помощью безбиотиновой системы детекции на основе пероксидазы хрена («BioGenex», США). Срезы докрашивали гематоксилином Майера.

В качестве индикатора пролиферативной активности использовали индекс пролиферации (ИП) Ki-67, который определяли долей интенсивно окрашенных ядер при учете 300 клеток, выраженной в процентах. Интенсивность ИГХ-реакции с MMП-9 оценивали по следующим параметрам: 0 баллов — отсутствие коричневых гранул в цитоплазме клеток, 1 — наличие отдельных мелких гранул в цитоплазме единичных эпителиоцитов, 2 — распределение мелких гранул более чем в 50% эпителиоцитов, 3 — появление крупных гранул в отдельных эпителиоцитах на фоне мелких гранул более чем в 50% эпителиоцитов, 4 балла — наличие крупных гранул более чем в 50% эпителиоцитов.

Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Statistica 6.0. В таблицах приведены средние значения М±s, где s — среднее квадратичное отклонение. Учитывая ненормальное распределение полученных статистических показателей, сравнение двух независимых групп осуществляли непараметрическим методом c помощью U-критерия Манна—Уитни. Достоверным считали различия средних при p<0,05.

Для оценки агрессивности опухолевых образований принято исследовать пролиферативную активность клеток. В настоящем исследовании для изучения одонтогенной кисты и опухолей использовали ИП Ki-67. Поскольку в одонтогенных кистах и кератокистозной одонтогенной опухоли хорошо различимыми являются базальный и парабазальные слои, а в амелобластомах — периферический слой и центральный звездчатый ретикулум, ИП определяли именно в этих структурных образованиях.

В фолликулярной кисте, кератокистозной одонтогенной опухоли и амелобластоме выявлен широкий спектр пролиферативной активности. При исследовании группы фолликулярных кист пролиферативная активность выявлялась как в клетках базального слоя, так и в парабазальных областях (рисунок, а)

Амелобластомы характеризовались более высокой пролиферативной активностью периферического клеточного слоя по сравнению с клетками, составляющими звездчатый ретикулум. При ИГХ-исследовании экспрессия белка Ki-67 наблюдалась в ядрах эпителиальных клеток островков эпителиальных клеток с высокими цилиндрическими клетками по периферии. Звездчатые клетки рыхлой сети центральной части островков проявляли слабую пролиферативную активность (см. рисунок, д). При этом в одном и том же варианте амелобластомы наблюдались случаи как со слабой, так и с выраженной пролиферацией периферического слоя клеток. Количественные характеристики пролиферации клеток в амелобластомах по экспрессии белка Ki-67 представлены в табл. 1. Амелобластомы характеризовались высокой пролиферативной активностью в базальном клеточном слое (7,0±5,6%) по сравнению с рыхлой сетью клеток звездчатой формы (0,6±2,4%). Достоверные различия пролиферативной активности клеток базального слоя фолликулярных кист, кератокистозной одонтогенной опухоли с преобладанием гиперкератоза и паракератоза и периферического слоя амелобластом выявлены только для кератокистозной одонтогенной опухоли с преобладанием гиперкератоза. Статистически значимые различия пролиферативной активности клеток парабазального слоя фолликулярных кист, кератокистозной одонтогенной опухоли с преобладанием гиперкератоза и паракератоза и рыхлой сетью клеток звездчатой формы амелобластом выявлены между всеми видами кист и опухолей.

Таким образом, максимальной пролиферативной активностью базального слоя клеток обладает кератокистозная одонтогенная опухоль с преобладанием гиперкератоза. Максимальная пролиферативная активность парабазального клеточного слоя выявлена в кератокистозной одонтогенной опухоли с преобладанием паракератоза, пролиферативная активность базального и парабазального клеточных слоев фолликулярной кисты занимает промежуточное место. В амелобластомах выраженная пролиферативная активность клеток отмечается в периферическом клеточном слое, в то время как клетки звездчатого ретикулума обладают слабой пролиферативной активностью.

Экспрессию ММП-9 исследовали в клетках различных одонтогенных образований — от фолликулярных кист до амелобластомы. Фермент выявлялся в цитоплазме опухолевых клеток в виде мелких или крупных гранул, при этом отмечалась разная интенсивность ее окрашивания продуктами диаминобензидиновой реакции. На рисунке, б представлена слабая ИГХ-реакция в эпителиальных клетках фолликулярной кисты с антителами к белку MMП-9: мелкие коричневые гранулы распределяются в цитоплазме эпителиальных клеток базального и парабазального клеточных слоев. Подобная слабая ИГХ-реакция выявлялась и в большинстве эпителиальных клеток кератокистозной одонтогенной опухоли с преобладанием гиперкератоза. Выраженная диаминобензидиновая реакция отмечена в эпителии базального и парабазального клеточных слоев кератокистозной одонтогенной опухоли с преобладанием паракератоза (см. рисунок, г), периферическом клеточном слое и рыхлой сети клеток звездчатой формы амелобластомы (см. рисунок, е). Результаты полуколичественного анализа распределения MMП-9 в разных одонтогенных образованиях представлены в табл. 2.

Наименьший уровень экспрессии MMП-9 отмечен в фолликулярной кисте и кератокистозной одонтогенной опухоли с преобладанием гиперкератоза (0,4±0,5 усл. ед.). В кератокистозной одонтогенной опухоли с преобладанием паракератоза уровень экспрессии MMП-9 увеличивался почти в 3 раза, однако достоверных различий между ними не выявлено из-за большого разброса показателей. Максимальный уровень экспрессии MMП-9 наблюдался в амелобластоме (1,9±1,3) и достоверно отличался от аналогичного показателя в фолликулярной кисте и кератокистозной одонтогенной опухоли (см. табл. 2).

В нашем исследовании в фолликулярных кистах выявлено небольшое число пролиферирующих клеток в базальном и парабазальном слоях, по сравнению с данными других исследователей [6], что предполагает их очень низкую пролиферативную активность, которая связана с наличием 2—3 слоев эпителиальных клеток. Высокая пролиферативная активность в базальном слое клеток и ее отсутствие в парабазальных слоях кератокистозной одонтогенной опухоли с преобладанием гиперкератоза свидетельствует о зрелом эпителии, который в большей степени напоминает многослойный плоский эпителий слизистой оболочки рта [12].

Характеристики пролиферативной активности кератокистозной одонтогенной опухоли с преобладанием паракератоза в нашем исследовании соответствовали данным, полученным в другой работе, в которой показано, что пролиферирующие клетки в основном располагаются в парабазальной клеточной зоне [6]. Эта необычная пролиферация представляет эпителиальную дезорганизацию и может соответствовать эпителиальной дисплазии, поскольку именно в этой области отмечается повышенная пролиферация клеток при плоскоклеточной интраэпителиальной неоплазии эпителия слизистой оболочки рта [12, 13].

Таким образом, кератокистозные одонтогенные опухоли с преобладанием паракератоза по сравнению с фолликулярными кистами и кератокистозными одонтогенными опухолями с преобладанием ортокератоза можно охарактеризовать как локально агрессивные кистозные неоплазмы низкой злокачественности.

В нашем исследовании не выявлено достоверных различий в пролиферативной активности клеток между различными вариантами амелобластомы, что согласуется с данными других исследователей [5, 14, 15]. Этот факт свидетельствует о том, что определенный гистологический вариант амелобластомы не может служить прогностическим фактором, однако для подтверждения этого предположения необходимы дальнейшие подобные исследования с использованием большего числа случаев для каждого гистологического варианта.

В настоящей работе выявлена повышенная концентрация фермента ММП-9 в эпителиальных клетках кератокистозной одонтогенной опухоли с преобладанием паракератоза и амелобластомы. Этот фермент разрушает разные компоненты внеклеточного матрикса [16]. Однако ММП не только растворяют костные компоненты, но также являются регуляторами и инициаторами резорбции кости [13, 17]. Основываясь на подобных сообщениях, мы можем предположить, что секреция ММП-9 амелобластомой инициирует резорбцию кости и растворение матрикса.

Показатели экспрессии Ki-67 и MMП-9 позволяют различать доброкачественные одонтогенные образования (фолликулярные кисты и кератокистозные одонтогенные опухоли с преобладанием гиперкератоза) и одонтогенные опухоли, характеризующиеся агрессивным клиническим течением (кератокистозные одонтогенные опухоли с преобладанием паракератоза и амелобластомы). Высокая экспрессия белка Ki-67 и ММП-9 в кератокистозной одонтогенной опухоли с преобладанием паракератоза и амелобластоме может объяснить такие их характеристики, как быстрый рост и рецидивы после радикального удаления. С клинической точки зрения новообразования с более высокой экспрессией ММП-9 имеют более агрессивное течение, и данный показатель может быть использован как прогностический маркер дальнейшего клинического течения одонтогенных новообразований.