Ноцицептивная чувствительность у крыс в условиях хронического непредсказуемого мягкого стресса при введении блокатора рецепторов врожденного иммунного ответа

Стресс рассматривают как состояние, при котором возникают нарушения гомеостаза под действием отрицательных эмоциогенных факторов [1]. Изменения гомеостаза, обусловленные активацией гипоталамо-гипофизарно-надпочечникового комплекса, сопряжены с перестройкой регуляции продукции стресс-реализующих гормонов и оказывают модулирующее влияние на иммунные функции [2]. Установлено, что острые стрессорные воздействия приводят к кратковременной активации иммунной системы с преобладанием реакций врожденного иммунитета с сопутствующим повышением концентрации цитокинов с провоспалительной активностью (интерлейкин (IL)-1β, IL-6) [3]. Следует подчеркнуть, что в состоянии острого стресса как провоспалительные цитокины (IL-1β), так и противовоспалительные цитокины (IL-4) оказывают модулирующее влияние на состояние иммунокомпетентных органов [4]. В свою очередь, длительный стресс характеризуется чрезмерной активацией гипоталамо-гипофизарно-надпочечникового комплекса, что связано с развитием глюкокортикоидной резистентности Т-лимфоцитов и их субпопуляций [5]. Стрессорные воздействия оказывают модулирующее влияние на ноцицептивную систему у млекопитающих. В частности, было показано, что продолжительное воздействие стрессоров изменяет функциональную активность лимбических структур мозга, способствует развитию нейровоспаления и нарушению функций антиноцицептивной системы [5, 6]. В предыдущих исследованиях на крысах установлено, что хронические стрессорные нагрузки приводят к изменению различных форм поведения, в частности двигательной и ориентировочно-исследовательской активности [7].

Длительные стрессорные нагрузки сопровождаются высвобождением поврежденными клетками эндогенных молекулярных паттернов, связанных с повреждением (Damage-associated molecular patterns — DAMPs): белков теплового шока, HMGB1 (high-mobility group protein B1, амфотерин) и других. В указанных процессах важную роль играют Toll-подобные рецепторы 4-го типа (Toll-like receptor 4 — TLR4), которые обеспечивают распознавание DAMPs иммунными клетками [8] и способствуют активации механизмов врожденного иммунитета. Указанные рецепторы локализованы как на иммунных, так и на других типах клеток у млекопитающих. Показано, что у мышей после хронического иммобилизационного стресса (ежедневное 2-часовое ограничение подвижности в течение 2 нед) наблюдается повышение экспрессии указанных рецепторов в гиппокампе, увеличение концентрации провоспалительных цитокинов в плазме крови и тканях головного мозга [9].

Следует подчеркнуть, что в нейральных клетках микроглии и макрофагах спинномозговых ганглиев TLR4 опосредованно участвуют в возникновении и реализации ноцицептивных реакций [10]. Кроме того, на модели хронического стресса социального поражения у самцов мышей с нокаутом гена рецепторов врожденного иммунитета было продемонстрировано снижение ноцицептивной чувствительности по сравнению с особями дикого типа [8].

Перспективным подходом к изучению иммунозависимых механизмов формирования ноцицептивных реакций при стрессорных нагрузках является применение ингибиторов TLR4. К их числу относится селективный ингибитор CLI-095, который широко используется в экспериментах на животных [11].

Для изучения последствий длительных стрессорных воздействий применяют модель хронического непредсказуемого мягкого стресса (ХНМС). Это позволяет воспроизводить изменения, характерные для состояния длительного стресса, включая дисрегуляцию гипоталамо-гипофизарно-надпочечникового комплекса и развитие нейровоспаления [12]. Используемый в данной модели подход основан на последовательном чередовании различных стрессоров, что позволяет исключить адаптацию к повторяющимся отрицательным эмоциогенным нагрузкам [13].

Следует отметить, что в современной научной литературе данные об изменениях ноцицептивной чувствительности при воздействии хронических стрессогенных факторов в условиях подавления иммунного ответа представлены недостаточно.

Цель исследования — изучение ноцицептивной чувствительности у крыс в условиях хронического непредсказуемого мягкого стресса разной длительности при предварительном введении блокатора рецепторов врожденного иммунного ответа.

Исследование проведено на половозрелых самцах крыс Wistar (n=80, масса тела 265,5±23,6 г). Эксперименты одобрены комиссией по биомедицинской этике ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр оригинальных и перспективных биомедицинских и фармацевтических технологий» (протокол №2 от 13.02.2024). Все процедуры выполнены в соответствии с требованиями Всемирного общества защиты животных (WSPA) и Европейской конвенции по защите экспериментальных животных. Животные содержались в стандартных условиях вивария и прошли 14-дневный период адаптации после доставки из питомника «Столбовая».

Было сформировано 8 групп животных. Крыс всех экспериментальных групп подвергали чередующимся стрессорным воздействиям различной длительности в модифицированной модели ХНМС [14]. Данная модель предусматривает применение мягких стрессоров в течение 7 дней. К используемым стрессорам относились наклон клетки на 30° в течение 7 ч; дневное освещение 17 ч; загрязненная клетка (0,5 мл воды в опилки) 24 ч; питьевая депривация 12 ч; пустая бутылка 12 ч; пищевая депривация 24 ч; тесная клетка (300×150×150 мм, 5 особей) 24 ч; удаление подстилки 24 ч. Недельное предъявление последовательности вышеуказанных стрессоров представляло собой одну серию. Было проведено 4 серии (1—4 нед) в зависимости от дизайна исследования.

Особи всех групп до ХНМС получали однократную внутрибрюшинную инъекцию следующих растворов: для четырех групп ДМСО-С (С-ХНМС, 1—4 недели) — 1% диметилсульфоксид (ДМСО) (димексид, ООО «Тульская фармацевтическая фабрика», Россия); для четырех групп CLI-095-С (С-ХНМС, 1—4 нед) — селективный блокатор TLR4 (CLI-095, резаторвид, Invivogen, Франция) в дозе 2 мг/кг массы тела, растворенный в 0,9% NaCl с доведением общего объема до 1 мл [11].

Перцептуальный компонент ноцицепции крыс оценивали по латентному периоду реакции отведения хвоста (ЛПРОХ, с) при светотермальном раздражении [11]. Эмоциональный компонент ноцицептивной чувствительности анализировали по показателю порога вокализации (ПВ, мА) при электрокожном раздражении хвоста [11].

Статистическую обработку данных проводили с использованием программ GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, США) и Microsoft Office Excel 2021 (Microsoft, США). Так как распределение данных отличалось от нормального (тест Шапиро—Уилка), для оценки изменений показателей применяли непараметрический парный критерий Уилкоксона для связанных выборок (сравнения типа «до и после»). Поскольку исходные значения изучаемых показателей крыс между группами не различались (критерий Краскела—Уоллиса с поправкой по Данну), межгрупповое сравнение параметров групп ДМСО-С и CLI-095-С проводили между показателями после ХНМС к концу каждой недели эксперимента (1—4 нед) с использованием U-критерия Манна—Уитни. Данные на рис. 1, 2 представлены в процентах от исходного уровня (100%). Принятый уровень значимости различий составляет 5%.

Рис. 1. Латентные периоды реакции отведения хвоста (ЛПРОХ) крыс на разных сроках эксперимента, в процентах от исходного уровня, 100%.

Здесь и на рис. 2: ДМСО — диметилсульфоксид; ХНМС — хронический непредсказуемый мягкий стресс; ДМСО-С — предварительная инъекция ДМСО и ХНМС; CLI-095-С — предварительная инъекция ингибитора TLR4 и ХНМС; С1—С4 — недели эксперимента. * — p<0,05, ** — p<0,01 по сравнению с исходным состоянием, ^{^} — p<0,05 по сравнению с ДМСО-С3.

Рис. 2. Пороги вокализации (ПВ) крыс на разных сроках эксперимента, в процентах от исходного уровня, 100%.

Изменения ЛПРОХ у животных в разные периоды эксперимента представлены на рис. 1, изменения ПВ — на рис. 2.

При изучении изменений показателя перцептуального компонента ноцицепции у крыс при внутригрупповом сравнении были получены следующие результаты. По окончании 1-й и 2-й недель многократных стрессогенных воздействий у животных с предварительным введением ДМСО при светотермальном раздражении ЛПРОХ увеличивался на 27,7% (p=0,009) и 37,9% (p=0,019) соответственно по сравнению с исходными значениями. По окончании 3-й и 4-й недель статистически значимых различий в сравнении с исходными значениями в исследуемых группах не выявлено.

У животных с предварительной инъекцией CLI-095 до ХНМС статистически значимых различий от исходных значений не обнаружено ни на одном из сроков наблюдений (1—4 нед).

При межгрупповом сравнении показателя ЛПРОХ были установлены следующие различия. По окончании 3-й недели последовательных стрессорных воздействий у особей с предварительной инъекцией CLI-095 параметр ЛПРОХ при ноцицептивном раздражении был выше на 20,7% (p=0,006) по сравнению с животными с предварительным введением ДМСО и последующим ХНМС. По окончании 1-й, 2-й и 4-й недель статистически значимых межгрупповых различий не обнаружено.

На следующем этапе исследования были проанализированы внутригрупповые изменения показателя эмоционального компонента ноцицептивной чувствительности у животных. Установлено, что у особей с введением ДМСО по окончании 1-й, 2-й и 3-й недель стрессогенных воздействий статистически значимых изменений анализируемого показателя не выявлено. Статистически значимые различия были обнаружены у крыс после 4-й недели стрессогенных нагрузок. В этой экспериментальной группе животных ПВ снижался на 41,9% (p=0,006) по сравнению с исходными значениями. При анализе изменений показателя ПВ у крыс с инъекцией CLI-095 и последующими стрессорными нагрузками к концу 1-й, 2-й и 4-й недель изменения изучаемого параметра не были статистически значимыми. К концу 3-й недели у животных с введением блокатора рецепторов врожденного иммунитета показатель ПВ увеличился на 36,6% (p=0,024) по сравнению с исходными данными.

При межгрупповом сравнении по окончании 1-й, 2-й и 4-й недель статистически значимых различий ПВ у исследуемых крыс обнаружено не было. К концу 3-й недели у особей с предварительной инъекцией CLI-095 и многократными стрессорными нагрузками показатель ПВ был выше на 38,5% (p=0,022) по сравнению с таковым у крыс с введением ДМСО и последующими стрессогенными воздействиями.

В представленной работе изучен характер изменений перцептуального и эмоционального компонентов ноцицептивных реакций у крыс в условиях предварительного введения блокатора TLR4 при ХНМС различной длительности.

На ранних этапах эксперимента (1-я и 2-я недели) у животных, подвергнутых только ХНМС, было отмечено снижение перцептуального компонента ноцицепции, что может отражать развитие стресс-индуцированной анальгезии [15], тогда как в более поздние сроки эксперимента (3-я и 4-я недели) показатели ноцицептивной чувствительности не отличались от исходных значений. Известно, что стресс-индуцированная анальгезия опосредована активацией эндогенных опиоидных систем, а также вовлечением серотонинергических и норадренергических эфферентных путей в регуляцию передачи ноцицептивной информации на уровне спинного мозга [16]. Кроме того, стрессогенные воздействия могут оказывать влияние на нейроиммуноэндокринные механизмы регуляции физиологических функций, которые играют важную роль в модуляции болевой чувствительности [5, 17].

Было продемонстрировано, что перцептуальный компонент ноцицепции крыс при повторных стрессорных воздействиях в течение 1-й и 2-й недель не изменяется в условиях предварительного введения TLR4 по сравнению с исходными показателями. Можно предположить, что введение ингибитора рецепторов врожденного иммунного ответа на ранних сроках ХНМС предупреждает стресс-индуцированное снижение ноцицептивной чувствительности. Установлено, что TLR4 экспрессируются, в частности, микроглиальными клетками центральной нервной системы и участвуют в активации сигнальных каскадов с продукцией медиаторов воспаления [18]. В экспериментах на различных моделях хронической боли установлено, что чрезмерная активация рецепторов врожденного иммунного ответа может способствовать развитию центральной сенситизации и усилению ноцицептивной передачи [18, 19]. В условиях блокады рецепторов врожденного иммунитета наблюдается подавление активации микроглии и, как следствие, снижение интенсивности нейровоспалительных процессов. В исследовании на модели хронического иммобилизационного стресса у животных показано, что длительные стрессорные воздействия сопровождаются увеличением болевой чувствительности, а также повышением экспрессии TLR4 в дорсальных корешковых ганглиях [20]. При этом блокада рецепторов врожденного иммунитета приводит к уменьшению выраженности выявленных изменений.

В нашем исследовании установлено, что на 3-й и 4-й неделях эксперимента у животных всех групп не отмечается статистически значимых различий показателя перцептуального компонента ноцицепции по сравнению с исходными значениями, что может косвенно свидетельствовать об адаптации к предъявляемым стрессогенным факторам. Однако при межгрупповом сравнении у крыс с введением ингибитора рецепторов врожденного иммунного ответа по окончании 3-й недели опытов ноцицептивная чувствительность была ниже, чем у особей в условиях изолированного ХНМС. Полученные результаты могут свидетельствовать о том, что блокада TLR4 приводит к снижению ноцицептивной чувствительности в условиях длительных стрессорных воздействий [20].

У животных, находившихся только в условиях ХНМС, эмоциональный компонент ноцицепции не изменялся в 1—3-ю недели эксперимента, но снижался к 4-й неделе стрессогенных воздействий по сравнению с исходными параметрами.

У животных с инъекцией CLI-095 по окончании 1-й, 2-й и 4-й недель опытов значимых изменений показателя эмоционального компонента ноцицепции не обнаружено. У крыс указанной группы к концу 3-й недели установлено повышение ПВ, что свидетельствует о подавлении эмоционального компонента ноцицептивной чувствительности. В эти сроки эксперимента у животных с введением блокатора TLR4 наблюдается ослабление эмоционального компонента ноцицепции по сравнению с таковым у животных, подвергнутых изолированным стрессорным воздействиям. Вероятно, указанные различия могут быть связаны с продукцией DAMPs и усиленной активацией лимбических структур [11]. Известно, что эмоциональный компонент боли отражает субъективное восприятие, реализация которого происходит в том числе с вовлечением лимбических структур мозга (это миндалина, префронтальная кора, поясная извилина, гиппокамп) [5, 6]. Указанные структуры играют ключевую роль в формировании памяти, в том числе о стрессорных воздействиях или ноцицептивных раздражителях как потенциальной угрозе для организма [21]. Неспецифические медиальные таламические ядра с проекциями в лимбические структуры принимают участие в оценке эмоционального восприятия боли. Указанный механизм лежит в основе изменений вегетативных реакций, гормональных и метаболических процессов, а также активации механизмов памяти, направленной на извлечение опыта по устранению болевых ощущений [22]. Перцептуальный компонент ноцицептивной чувствительности отражает собственно ощущение боли и реализуется преимущественно через специфические латеральные таламо-кортикальные ядра, что обеспечивает быструю обработку ноцицептивных сигналов. Можно предположить, что блокада TLR4 нивелирует вызванные стрессогенными воздействиями изменения ноцицептивной чувствительности у животных с изолированным ХНМС на 4-й неделе эксперимента.

Полученные данные могут служить предпосылкой для разработки новых подходов к поиску мишеней для лекарственных средств с целью предупреждения или коррекции стресс-индуцированных изменений болевой чувствительности.

На ранних сроках (1—2 нед) повторяющихся стрессогенных воздействий у крыс наблюдаются изменения перцептуального компонента ноцицептивной чувствительности, тогда как в поздний период (4 нед) — изменения эмоционального компонента ноцицептивной чувствительности.

На ранних сроках хронического непредсказуемого мягкого стресса (1—2 нед) предварительное системное введение блокатора TLR4 предупреждает вызванное повторяющимися стрессогенными воздействиями ослабление перцептуального компонента ноцицепции у животных.

На поздних сроках (3 нед) хронического непредсказуемого мягкого стресса после предварительной инъекции блокатора TLR4 у крыс наблюдается ослабление перцептуального компонента ноцицепции по сравнению с таковым у особей с изолированными стрессогенными воздействиями.

Выраженность эмоционального компонента ноцицептивной чувствительности животных на поздних сроках (3 нед) повторяющихся стрессогенных нагрузок в условиях предварительного введения блокатора TLR4 меньше, чем в исходном состоянии, а также чем у особей с изолированным моделированием хронического непредсказуемого мягкого стресса.

Усиления эмоционального компонента ноцицептивной чувствительности крыс на поздних сроках (4 нед) хронического непредсказуемого мягкого стресса не наблюдается в условиях предварительного введения блокатора TLR4.

Финансирование. Исследование выполнено в рамках госзадания «Исследование системных физиологических механизмов формирования психоэмоционального стресса и болевых реакций» №122040500027-7.

Funding. The study was carried out within the framework of the state assignment “Study of systemic physiological mechanisms of formation of psychoemotional stress and pain reactions” No. 122040500027-7.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.