Введение

В результате протеолиза коллагеновых волокон различного типа в организме происходит образование пептидов GHK и PGP, которые обладают широким спектром биологической активности и свойствами регуляторных молекул [1—3].

Известно, что GHK действует на процессы ранозаживления, синтеза коллагена, гликозаминогликанов, дерматансульфата и хондроитинсульфата, протеоглигана декорина, на активность фибробластов, миграцию иммунных и эндотелиальные клеток к месту повреждения [2, 4]. Ранее нами были установлены отдельные нейротропные эффекты GHK, в том числе его влияние на болевую чувствительность у мышей [5]. Также пептид GHK вследствие нейропротекторного действия и данных исследований in vitro рассматривается как потенциальное лекарственное средство для лечения болезни Альцгеймера [5].

При этом существенным недостатком GHK является непродолжительность его действия по причине деградации протеазами. Одним из способов повышения устойчивости GHK и пролонгирования его биологических эффектов является присоединение защитных пролинсодержащих пептидных последовательностей [6]. В частности, данный подход был реализован при защите N-концевых фрагментов адренокортикотропного гормона при создании препаратов «Семакс» и «Селанк» [7, 8].

Аминокислотная последовательность PGP также входит в состав коллагеновых волокон различного типа, из которых вычленяется под действием металлопротеиназ и пролилэндопептидазы. В дальнейшем PGP ацетилируется под действием активных альдегидов в очаге воспаления, является хемоаттрактантом нейтрофилов, участвует в процессах регуляции регенерации и заживления ран [3, 9]. В условиях стресса PGP способствует нормализации уровня провоспалительных интерлейкинов и нейротрофических факторов, что свидетельствует о нейропротекторном эффекте трипептида [10, 11]. Также установлено, что пептид Pro-Gly-Pro активно подавляет процессы свободнорадикального окисления в гипоталамической и перифронтальной областях головного мозга, развивающиеся в условиях стресса [12, 13]. Однако, несмотря на широкий спектр установленных биологических эффектов PGP, его влияние на болевую чувствительность не было исследовано. Кроме того, при защите пептида GHK пролинсодержащими аминокислотными цепями его биологические эффекты, в том числе влияние на болевую чувствительность, могли измениться.

Цель исследования — изучение влияния пептидов GHK, PGP и GHK-PGP на спинальные и супраспинальные механизмы формирования температурной болевой чувствительности у крыс.

Материал и методы

Эксперименты выполнены на 100 крысах-самцах Wistar массой 170—190 г, полученных из SPF-вивария Института цитологии и генетики СО РАН, прошедших карантинный контроль вивария ФГБОУ ВО «Курский государственный медицинский университет» Минздрава России. Животные содержались в клетках по 10 особей в стандартных условиях вивария при 12-часовом световом режиме (12 ч — свет, 12 ч — темнота) и температуре 22±2°С.

Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены. Все процедуры проводили в соответствии с Директивой ЕС о защите животных, используемых в научных целях, — EU Directive 2010/63/EU, принятой 22 сентября 2010 г., «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Министерства здравоохранения РФ от 23.08.2010 №708н, соответствовали принципам Базельской декларации. Эксперименты проводились под контролем этического комитета ФГБОУ ВО «Курский государственный медицинский университет» Минздрава России (протокол заседания №3 от 7 октября 2016 г.).

В работе были использованы пептиды GHK, PGP, GHK-PGP, синтезированные в лаборатории молекулярной фармакологии пептидов НИЦ «Курчатовский институт».

Пептиды, растворенные в физиологическом растворе, вводили внутрибрюшинно за 15 мин до начала эксперимента в дозах 0,5 мкг/кг, 5,0 мкг/кг и 50,0 мкг/кг однократно. Контрольным животным вводили эквивалентные объемы физиологического раствора из расчета 1 мл на 1 кг массы тела. Животные были разделены на 10 групп по 10 крыс в каждой (9 опытных групп и 1 контрольная).

Изучение болевой чувствительности при термическом воздействии проводили с использованием теста горячей пластины (hot plate), а также теста отдергивания хвоста от теплового излучения (tail-flick) [14] с использованием экспериментальных установок Hot-Plate (модель LE7406) и Tail Flick (модель LE7106) (PanLab Harvard Apparatus, Испания). В тесте горячей пластины при температуре 53°С проводили 5 испытаний с интервалом 15 мин: двукратное измерение исходного болевого порога (с вычислением среднего значения исходного болевого порога) до введения пептида и 3 измерения болевого порога после введения пептида с интервалом в 15 мин. В тесте отдергивания хвоста от теплового излучения болевое раздражение наносили на середину хвоста локально тепловым излучением интенсивностью 50 единиц по шкале прибора и регистрировали латентный период реакции избавления от болевого раздражителя. Проводили 5 измерений: дважды до введения пептида (с вычислением среднего значения исходного болевого порога) и 3 измерения болевого порога после введения пептида с интервалом в 15 мин. При обработке полученных результатов рассчитывали величину максимально возможного эффекта по формуле:

МВЭ=(ЛПоп–ЛПконтр)/MAXвремя–ЛПконтр)×100%,

где МВЭ — максимально возможный эффект, ЛПоп — латентный период реакции после введения вещества, ЛПконтр — латентный период реакции до введения вещества, МАХвремя — максимальное время нанесения раздражителя (30 с для теста горячей пластины и 9 с для теста отдергивания хвоста от теплового излучения).

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием программы Statistica 13 (StatSoft, США). Характер распределения признаков в статистической выборке определяли с помощью критерия Шапиро—Уилка. С учетом непараметрического характера распределения признаков значимость полученных результатов оценивали с применением непараметрического однофакторного дисперсионного анализа с помощью критериев Краскела—Уоллиса и Манна—Уитни. Полученные результаты представлены в виде медианы (Me), нижнего и верхнего квартилей (Q₁ и Q₃). Результаты считали статистически значимыми при уровне p≤0,05.

Результаты

В тесте горячей пластины пептид GHK через 45 мин после введения в дозе 0,5 мкг/кг увеличивал максимально возможный эффект более чем в 3 раза (p=0,038) по сравнению с контрольной группой, а в дозе 50,0 мкг/кг повышал данный показатель на 23,7 единицы (p=0,014), что свидетельствует о статистически значимом анальгетическом эффекте данного пептида. При этом в тесте отдергивания хвоста от теплового излучения пептид GHK не оказывал влияния на болевую чувствительность (таблица).

Влияние пептидов GHK, PGP, GHK-PGP на температурную болевую чувствительность у крыс в тесте горячей пластины и тесте отдергивания хвоста от теплового излучения

Примечание. Данные представлены в виде медианы (Me), нижнего и верхнего квартилей (Q₁ и Q₃) в формате Me (Q₁; Q₃). МВЭ — максимально возможный эффект. * — p≤0,05 — статистически значимое отличие по сравнению с контрольной группой.

Пептид PGP в тесте горячей пластины через 15 мин после введения в дозе 0,5 мкг/кг увеличивал максимально возможный эффект на 10,2 единицы (p=0,021). При этом наблюдалась тенденция к увеличению данного показателя через 30 мин и 45 мин после введения соответственно на 16,5 единицы (p=0,162) и 8,4 единицы (p=0,076). В тесте отдергивания хвоста от теплового излучения статистически значимого эффекта у данного пептида обнаружено не было.

Пептид GHK-PGP в дозе 0,5 мкг/кг демонстрировал статистически значимый анальгетический эффект лишь через 45 мин после введения (p=0,004), а через 15 мин и 30 мин отмечалась только тенденция к повышению максимально возможного эффекта — соответственно на 8,4 единицы (p=0,064) и 10,2 единицы (p=0,212). В дозе 5 мкг/кг максимально возможный эффект повышался через 30 мин после введения на 30 единиц (p=0,022), а через 45 мин — на 23 единицы (p=0,045). В дозе 50,0 мкг/кг через 15 мин исследуемый показатель увеличивался на 11 единиц (p=0,018), через 30 мин его изменение не достигало статистически значимого уровня (p=0,307), а через 45 мин увеличение максимально возможного эффекта вновь было статистически значимым и составило 12,1 единицы (p=0,027). В тесте отдергивания хвоста от теплового излучения пептид GHK-PGP показал выраженный анальгетический эффект в дозе 0,5 мкг/кг через 30 мин после его введения (p=0,017), а через 15 мин отмечалась тенденция к увеличению максимально возможного эффекта (p=0,064).

Обсуждение

Полученные результаты свидетельствуют о том, что GHK обладает анальгетическим действием при однократном введении перед тестированием температурной болевой чувствительности: в дозе 0,5 мкг/кг и 50,0 мкг/кг пептид увеличивал латентный период облизывания лап у крыс в тесте горячей пластины, что согласуется с результатами наших предыдущих исследований [5]. Следует отметить, что введение GHK приводит к изменению экспрессии ряда генов, участвующих в работе антиноцицептивной системы. В частности, установлено увеличение экспрессии OPRMI (μ₁-опиатный рецептор), OPRL1 (рецептор ноцицептина), CCKAR (рецептор холецистокинина А), CNR1 (каннабиноидный рецептор), PNOC (препроноцицептин), OXT (предшественник окситоцина/нейрофизина I), а также снижение экспрессии AMPA3/GRIA3 (глутаматный рецептор) и OPRK1 (κ-опиоидный рецептор 1) [15]. Данные факты позволяют предполагать участие GHK в пептидергических механизмах развития болевой реакции при термическом воздействии.

Пептид PGP также оказывал анальгетическое действие, наиболее выраженное в минимальной исследуемой дозе.

Эффекты пептида GHK-PGP были выражены во всех исследуемых дозах, что свидетельствует о потенцировании анальгетического действия пептидов GHK и PGP при их соединении в одну молекулу. При этом пептид GHK-PGP в минимальной исследуемой дозе в тесте горячей пластины проявил свое анальгетическое действие только через 45 мин после его введения. Данный эффект может являться следствием не прямого действия самого пептида GHK-PGP, а действия GHK и PGP, образовавшихся из GHK-PGP в результате протеолиза. В максимальной исследуемой дозе в тесте горячей пластины пептид GHK-PGP проявил свое анальгетическое действие как через 15 мин, так и через 45 мин после его введения. В данном случае это может свидетельствовать как о непосредственном прямом анальгетическом эффекте GHK-PGP, так и об анальгетическом действии GHK и PGP, образующихся в результате действия протеолитических ферментов. Также при анализе возможных механизмов установленных в работе эффектов необходимо учитывать, что пептидные молекулы с регуляторными свойствами способны даже в небольших дозах являться пусковыми факторами для активации различных нейромедиаторных каскадов и структур мозга, в том числе участвующих в формировании болевых реакций [1, 16, 17].

Заключение

Таким образом, пептиды GHK и PGP оказывают анальгетическое влияние на болевые реакции у крыс с участием надсегментарных механизмов при температурном болевом воздействии в тесте горячей пластины. Соединение данных молекул в одну вызывает потенцирование данного эффекта, а также активацию сегментарных механизмов болевой чувствительности. Полученные данные также являются очередным свидетельством характерной для регуляторных пептидов физиологической полифункциональности.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.