В настоящее время хронический болевой синдром рассматривают как мультидисциплинарную проблему, касающуюся в том числе ревматических заболеваний. Болевой синдром возникает уже на ранних стадиях патологического процесса и приводит к существенным функциональным нарушениям, психологическим проблемам и социальным ограничениям, которые значительно ухудшают качество жизни пациентов и вызывают социальную дезадаптацию в относительно молодом, трудоспособном возрасте [1]. Долгое время болевой синдром при ревматоидном артрите (РА) и остеоартрите (ОА) традиционно рассматривали как ноцицептивную боль. Проводимые на современном этапе клинико-экспериментальные исследования показали заинтересованность центральной нервной системы (ЦНС) в формировании хронического болевого синдрома. Современная концепция патогенеза хронического болевого синдрома включает три типа боли: ноцицептивную, нейропатическую и дисфункциональную, объединяющим механизмом хронизации которых является повышение реактивности центральных ноцицептивных нейронов. Усиление боли является конечным результатом такой центральной сенситизации.

Традиционная базовая терапия РА, направленная на ноцицептивный компонент боли, не всегда эффективно купирует болевой синдром. Согласно современным рекомендациям по лечению РА, применяемые для уменьшения боли в суставах нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) оказывают удовлетворительное симптоматическое действие. Однако эти препараты могут вызывать тяжелые нежелательные реакции со стороны желудочно-кишечного тракта, сердечно-сосудистой системы, ускорять деструкцию хряща, угнетая синтез простагландинов, пролиферацию хондроцитов, ингибируя ферменты, необходимые для выработки гликозаминогликанов [2, 3]. Так, изучение фенотипов боли при различной суставной патологии открыло путь к патогенетически направленной терапии, включающей применение препаратов других групп, в том числе витаминов группы В, антиконвульсантов. Однако до настоящего времени одной из ведущих задач фармакологии является поиск и создание новых анальгетических препаратов, не вызывающих побочных эффектов подобно НПВП, наркотическим анальгетикам и препаратам других групп, используемым для анальгезии, но при этом имеющих высокую степень эффективности и безопасности [3].

В связи с этим при поиске и разработке новых лекарственных средств (способов коррекции) для терапии и анальгезии ревматических заболеваний важную роль играет использование адекватных экспериментальных моделей [4]. Широкое распространение в настоящее время получила модель артрита у крыс при внутрикожном или подкожном введении полного адъюванта Фрейнда [4—6]. Такая модель РА у крыс по клиническому течению, патологическим и гистологическим данным близка к РА человека, также позволяет оценить эффективность препаратов, применяемых при артралгиях, миалгиях и других соматогенных болевых синдромах. Экспериментальная модель хорошо воспроизводится и позволяет изучать звенья патогенеза РА, а также выявлять профилактическое и терапевтическое действия лекарственных средств.

На протяжении последних лет в Научно-исследовательском институте фармакологии и регенеративной медицины (НИИФиРМ) им. Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ ведется разработка нового анальгетика на основе молекулы first-in-class гексаазаизовюрцитана (далее — тиовюрцин), синтезированной в ИПХЭТ СО РАН (Бийск). Приоритет изобретения подтвержден патентом № 2565766 РФ «4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,12-тетрааце-тил-2,4,6,8,10,12гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11,0^5,9]додекан в качестве анальгетического средства и способ его получения». Доклиническое изучение тиовюрцина проведено с использованием современных общепринятых ноцицептивных тестов для понимания нейронных механизмов болевых синдромов, включающих моделирование соматической, висцеральной, острой и тонической боли, индуцированной механическими, термическими и химическими стимулами. Выявлена выраженная анальгетическая активность инновационного соединения в условиях термического ноцицептивного теста «горячая пластина» и модели острой висцеральной и соматически глубокой боли «уксусные корчи», сравнимая и/или превышающая действие диклофенака натрия, кеторолака и трамадола. Отсутствие влияния тиовюрцина на продукцию основных медиаторов воспаления (гистамина, серотонина, простагландина) и ульцерогенной активности в диапазоне доз 25—200 мг на 1 кг массы тела (главным образом, при хроническом 90-дневном применении) позволило сделать заключение о его ЦОГ-независимом механизме обезболивающего действия [7]. Выявлена возможность участия нейротрансмиттера ацетилхолина, брадикинина, арахидоновой кислоты в механизме анальгетического действия тиовюрцина [8]. Соединение можно отнести к 3-му классу опасности (доза ЛД₅₀ находится в пределах 150—5000 мг на 1 кг массы тела), ГОСТ 12.1.007-76. При максимально возможном объеме однократного введения тиовюрцина ЛД₅₀ (или гибели животных) не достигнуто. В результате исследования механизма действия тиовюрцина выявлена Налоксон-чувствительная анальгезия, при этом доказано отсутствие тропности к периферическим опиоидным рецепторам с использованием налоксона метиодита [7]. Доказано противосудорожное действие Тиовюрцина на моделях судорог различного генеза, в результате чего получен патент РФ на изобретение №2684107 «4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,12-тетраацетил2,4,6,8,10,12гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11,0^5,9] додекан в качестве противосудорожного средства».

По результатам доклинических исследований свойств, которые могли бы препятствовать дальнейшему исследованию данного анальгетика в клинических испытаниях, не выявлено. Полученные данные свидетельствуют о том, что тиовюрцин не вызывает эффектов, характерных для опиоидных анальгетиков: отсутствует негативное влияние на желудочно-кишечный тракт, ЦНС (не вызывает развитие эйфории и седативного эффекта), не угнетает дыхательный центр и кроветворную систему. Самое важное, что даже после длительного приема анальгетика в эксперименте не развиваются лекарственная зависимость и синдром отмены. Полученные данные о безопасности и выраженном обезболивающем действии тиовюрцина позволяют сделать вывод о перспективности изучения выбранного соединения в качестве анальгетического средства для купирования боли средней и высокой интенсивности различного генеза.

Цель исследования — изучить противовоспалительную и анальгетическую активность готовой лекарственной формы на основе производного гексаазаизовюрцитана (тиовюрцин) при хроническом внутрижелудочном введении в дозе 100 мг на 1 кг массы тела на модели адъювантного артрита у крыс.

Материал и методы

В экспериментах использовали 30 аутбредных крыс-самцов сток SD (возраст 7—8 нед, масса 180—200 г) первой категории, конвенциональных, разводки отдела экспериментального биомоделирования НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ. Содержание животных и дизайн экспериментов одобрены Биоэтическим комитетом НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга (протокол IACUC № 96092015) и соответствовали Директиве 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях; приказу Минздрава России № 199н от 1 апреля 2016 г. «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики».

Хроническое иммунное воспаление моделировали субплантарным введением в правую заднюю лапу 0,1 мл адъюванта Фрейнда (взвесь БЦЖ 2,5 мг/мл в вазелиновом масле). Референс-препарат мелоксикам — селективный ингибитор ЦОГ2 (ООО «Озон», Россия) в дозе 10 мг на 1 кг массы тела и тиовюрцин в терапевтической дозе 100 мг на 1 кг массы тела (растворитель — водно-твиновая смесь) вводили внутрижелудочно через зонд ежедневно 30-дневным курсом. Предлагаемая доза референс-препарата соответствовала средней терапевтической дозе для человека. Животные группы негативного контроля получали эквиобъемные количества растворителя — водно-твиновой смеси в аналогичном режиме.

Воспалительную реакцию оценивали онкометрически в динамике каждые 2—3 дня. Фоновые значения объема лап измеряли в первые сутки эксперимента. Фиксировали симптомы генерализованной реакции организма на введение адъюванта (отек ушей, хвоста, полиартрит, снижение массы тела, гибель). Оценку антиноцицептивного действия лекарственных средств проводили по 5-балльной системе путем регистрации поведенческой реакции (вокализация) животных на сгибание воспаленной лапы [6]. В качестве основных критериев применяли стандартные показатели: болевая реакция (в баллах), количество животных с болевой реакцией (%). Эвтаназию (безболезненное умерщвление животного) производили в соответствии с требованиями GLP — передозировкой наркотических средств.

Объектом исследования является готовая лекарственная форма (ГЛФ) тиовюрцина (рис. 1). Активная фармацевтическая субстанция тиовюрцина — органическое низкомолекулярное соединение 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,12-тетраацетил2,4,6,8,10,12гексаазатетра-цикло[5,5,0,0^3,11,0^5,9]додекан (бесцветный кристаллический продукт с содержанием основного вещества 99% и единичной примеси не более 0,2% (метод ВЭЖХ), температурой плавления 328—330 °С). Характеристика соединения полностью подтверждена физико-химическими методами исследования: ИК-спектр, ν/см^–1, спектр ЯМР¹Н (ДМСО-d₆, δ, м.д.), спектр ЯМР¹³С (ДМСО-d₆, δ, м.д.).

Рис. 1. Химическая формула активной фармацевтической субстанции тиовюрцин.

Fig. 1. Chemical formula of active pharmaceutical substance Thiowurtzine.

По каждому из показателей рассчитаны элементы описательной статистики — средние арифметические значения и стандартные ошибки среднего. Различия считали статистически значимыми при p≤0,05. Критерий оценки статистической значимости различий в исследуемых группах выбран, исходя из малого объема выборки (количество животных в сравниваемых группах 10), дизайна исследования (независимые группы). Кроме того, малый объем выборки ограничивает возможности проверки гипотезы о нормальном распределении данных, в соответствии с этим для оценки различий в группах применяли непараметрический критерий проверки гипотез об однородности средних Вилкоксона—Манна—Уитни (U). Применяли угловой критерий Фишера (F) для парных сравнений [9, 10].

Результаты и обсуждение

На десятые сутки после введения адъюванта Фрейнда у крыс во всех группах фиксировали пик первичного иммунного ответа в виде максимального отека лапы (рис. 2). Так, у животных группы негативного контроля объем воспаленной лапы составлял 2,6±0,4 см³, тогда как у крыс, получавших тиовюрцин и мелоксикам, объем воспаленной лапы оказался 2,3±0,3 см³ (p<0,05) и 2,2±0,2 см³ (p<0,05) соответственно (см. рис. 2). Следует отметить, что статистически значимое различие противовоспалительного эффекта фиксировалось как между группами контроля и мелоксикама, так и между группами контроля и тиовюрцина. Анализ результатов дальнейшего измерения объема лап показал, что наиболее выраженным противовоспалительным эффектом на данной модели обладал НПВП — мелоксикам. Так, на 14-е сутки наблюдения изучаемый показатель у крыс группы мелоксикама был значительно ниже, чем у крыс группы контроля, — в 1,3 раза (p<0,05), тогда как объем воспаленной лапы у животных группы тиовюрцина сохранялся на прежнем уровне и не отличался от такового у крыс группы контроля. К 17-м суткам эксперимента объем воспаленной лапы нелеченых животных несколько снижался, при этом тиовюрцин не оказывал существенного влияния на данный показатель, в то время как мелоксикам уменьшал объем воспаленной лапы в 1,2 раза (p<0,05) по сравнению с соответствующим значением у животных группы негативного контроля.

Рис. 2. Динамика развития хронического иммунного воспаления лапы у крыс-самцов сток SD после введения адъюванта Фрейнда на фоне лечения тиовюрцином и мелоксикамом.

Fig. 2. Inflammatory reaction in rats after Freund’s adjuvant injection and subsequent treatment with Thiowurtzine and Meloxicam.

Динамика развития хронического иммунного воспаления лапы у крыс-самцов сток SD после введения адъюванта Фрейнда на фоне курсового лечебного введения ГЛФ тиовюрцина и мелоксикама представлена на рис. 2.

Дальнейшие наблюдения не выявили статистически значимых различий в объеме воспаленной лапы у крыс экспериментальных групп вследствие снижения иммунной реакция на введение адъюванта Фрейнда.

Результаты этой части исследования оказались сопоставимы с данными литературы, поскольку мелоксикам в терапевтической дозе 10 мг на 1 кг массы тела, вводимый крысам-самцам в лечебном режиме, проявил значительную противовоспалительную активность, причем выраженность патологической реакции на пике воспаления была существенно меньше, чем после введения тиовюрцина. В динамике воспаление на фоне лечения мелоксикамом не достигало максимальных значений и гораздо быстрее шло на спад, чем у леченных потенциальным анальгетиком животных. ГЛФ тиовюрцин в терапевтической дозе 100 мг на 1 кг массы тела per os при курсовом лечебном режиме вызывал статистически значимый противовоспалительный эффект только на пике первичного иммунного ответа. Полученные данные по тиовюрцину вполне согласуются с результатами экспериментов на моделях острого экссудативного воспаления «каррагениновый отек» и хронического пролиферативного воспаления «ватная гранулема» на крысах. Умеренная активность потенциального анальгетика объясняется тем, что противовоспалительное действие тиовюрцина более выражено в ранней фазе и на пике острого воспаления, это связано с его блокирующим эффектом на уровне медиаторов: брадикинина и арахидоновой кислоты [7].

На десятые сутки после введения адъюванта Фрейнда у крыс группы негативного контроля фиксировалось максимальное значение болевой реакции (таблица). Одним из критериев эффективности тестируемых препаратов является отсутствие гибели животных. В данной экспериментальной ситуации отмечена гибель 10% животных группы негативного контроля к этому сроку наблюдения.

Таблица. Динамика болевой реакции у крыс-самцов сток SD в результате развития хронического иммунного воспаления лапы после введения адъюванта Фрейнда на фоне применения мелоксикама и готовой лекарственной формы тиовюрцина в динамике

Table. Pain syndrome in SD male rats following Freund’s adjuvant injection and chronic immune inflammation in both groups

На пике иммунного ответа болевая реакция животных после введения ГЛФ тиовюрцина составляла 1,0±0,5 балла по сравнению с 3,6±0,7 балла (p<0,05) у животных группы негативного контроля и 2,6±0,5 балла (p<0,05) группы мелоксикама (см. таблицу). При этом доля животных с выраженной болевой реакцией (40%) оказалась статистически значимо ниже, чем в группах негативного контроля (78%, p<0,05) и мелоксикама (90%, p<0,01). Сходная направленность анальгетического действия тиовюрцина отмечалась и на 14-е сутки наблюдения. Если мелоксикам снижал болевую реакцию до 1,7±0,4 балла по сравнению с 2,6±0,8 балла у крыс группы контроля, то в случае применения тиовюрцина болевой ответ уменьшался до 0,3±0,3 балла. При этом в группе исследуемого анальгетика процент животных с проявлением болевой реакции (10%) оказался максимально сниженным как относительно соответствующего показателя у крыс группы контроля 67% (p<0,01), так и по сравнению со значением у животных группы мелоксикама 70% (p<0,01). Во все остальные сроки наблюдения при физиологическом затухании воспалительного процесса отмечалась тенденция к уменьшению болевой реакции как у крыс группы негативного контроля, так и у крыс двух экспериментальных групп (см. таблицу).

Результаты доклинического исследования тиовюрцина на основе производных гексаазаизовюрцитана свидетельствуют о его полимодальном механизме действия, включающем как опиоидный, так и неопиоидный компоненты, опосредованном через различные типы и локализацию биомишеней (ЦНС и/или периферической нервной системы). Полученные данные позволяют предполагать возможность модулирующего воздействия тиовюрцина на перестройку работы противоболевых систем в результате развития хронического воспаления при ревматических заболеваниях. При повреждении суставов и окружающих тканей, приводящих к выделению воспалительных медиаторов, активация арахидоновой кислоты способствует продукции простагландинов и лейкотриенов, миграции иммунных клеток в сторону поражения с последующим выделением цитокинов. Доказанное ингибирующее влияние тиовюрцина на биотрансформацию арахидоновой кислоты позволяет предполагать наличие не только снижения выраженности воспаления, что подтвердилось на этапе первичного иммунного ответа, но и уменьшения гиперчувствительности первичных афферентных нейронов, волокна которых иннервируют сустав. Снижение активации ноцицептивной системы, т.е. уменьшение периферической сенситизации ноцицепторов, может обусловить выраженное обезболивающее действие, которое также подтвердилось в динамике исследования тиовюрцина.

Ранее выявлено антиноцицептивное действие тиовюрцина на модели «горячая пластина», позволяющей не только оценить обезболивающее действие вещества на уровне сложной организации рефлекса с вовлечением корковых и подкорковых структур головного мозга, но и определить уровень вмешательства в нейромедиаторные процессы ЦНС [8]. Кроме того, доказанная противосудорожная активность тиовюрцина в тесте «коразоловые судороги» как при субхроническом введении, так и при однократном применении, умеренная противосудорожная активность на модели судорог, вызванных подкожным введением тиосемикарбазида, свидетельствуют о вовлечении в механизм анальгетического действия тиовюрцина ГАМК-ергических рецепторов ЦНС и о возможности блокады потенциал-зависимых Na⁺-каналов, влияния на Ca²⁺-зависимые-K⁺токи. Все это не исключает модуляцию боли на уровне ЦНС, т.е. воздействие на хронизацию всех типов боли, обусловленных центральной сенситизацией.

Заключение

Таким образом, установлено, что готовая лекарственная форма тиовюрцина при хроническом курсовом введении per os в терапевтической дозе 100 мг на 1 кг массы тела проявляет выраженную анальгетическую активность на модели хронического иммунного воспаления, вызванного субплантарным введением полного адъюванта Фрейнда крысам-самцам сток SD. При этом его анальгетическое действие значительно превосходит таковое у животных, леченных мелоксикамом. Кроме того, выявлено, что тиовюрцин оказывает выраженный противовоспалительный эффект только на пике первичного иммунного ответа, уступая препарату сравнения мелоксикаму в остальные сроки наблюдения. Совокупность полученных данных позволяет предполагать перспективность дальнейшего изучения нового высокоэффективного малотоксичного анальгетика в клинической ревматологии. Точками приложения тиовюрцина может быть как самостоятельное применение для терапии хронического болевого синдрома в процессе лечения ревматоидного артрита и остеоартрозов, так и в комплексной терапии этих заболеваний. Противовоспалительный эффект нестероидных противовоспалительных препаратов, полученный в течение короткого курса, может быть продолжен, а затем усилен тиовюрцином, который в силу отсутствия токсичности и высокой эффективности, возможно, будет препятствовать переходу в хронизацию с инверсивной и трудно поддающейся лечению нейрогенной болью.

Статья подготовлена с использованием материалов, полученных в рамках федеральной целевой программы «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 г. и дальнейшую перспективу». Государственный контракт от 15 августа 2017 г. № 14.N08.11.0179 «Доклинические исследования лекарственного средства на основе производных гексаазаизовюрцитана для терапии болевого синдрома различной этиологии».

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.