Введение

В последние годы были разработаны новые виды огнестрельного оружия с поражающими элементами из сплавов различных металлов, что привело к значительному увеличению травмирующего действия. Внедрение инородных тел в вещество головного мозга, помимо прямого повреждающего действия в момент проникновения, является потенциальным фактором не только инфицирования, но и локального токсического повреждения ЦНС, а также системного токсического поражения [1]. Известно, что металлические инородные тела с большим содержанием свинца в организме как человека, так и животных могут приводить к свинцовому отравлению, определяемому как плюмбизм [1—3].

Появление новых боеприпасов, состоящих из сплавов различных менее токсичных металлов, а также ближайшие результаты менее агрессивного хирургического лечения пострадавших с проникающими ранениями костными отломками или металлическими осколками, полученными в небольших локальных военных конфликтах [4—7], приводят в нейрохирургической среде к максималистским утверждениям, что рутинное извлечение металлических инородных тел у выживших пациентов нецелесообразно [4].

Вольфрам, никель, кобальт, железо, медь, алюминий, свинец и цинк как комбинация металлов, содержащихся в осколках, будут демонстрировать совершенно разные биокинетические, токсикологические и канцерогенные свойства и, следовательно, различную степень воздействия на здоровье человека [8].

При исследовании вольфрамовых сплавов (вольфрам, никель и кобальт), имплантированных в мышцы крыс, было обнаружено, что такой сплав приводил к возникновению высокоагрессивных рабдомиосарком, которые метастазировали в прочие органы, а другой вольфрамовый сплав (вольфрам, никель и железо) — нет [9, 10]. В связи с этим необходимы дополнительные исследования воздействия сплавов различных металлов, находящихся в организме, на здоровье человека и животных.

В настоящее время существует недостаток литературы, посвященной изучению токсического действия на головной мозг металлических инородных тел — осколков современных боевых поражающих элементов.

Цель исследования — оценка элементного состава и цитотоксичности металлических осколков современных ранящих снарядов, причиняющих минно-взрывные и осколочные черепно-мозговые ранения, в сравнении с пластинками титана (контроль) по отношению к клеточной линии человека T98G (человек, глиобластома, эпителиоподобная среда EMEM, источник клеточных линий — центр коллективного пользования «Коллекция культур клеток позвоночных», область применения: изучение механизмов остановки клеточной пролиферации).

Материал и методы

Исследование выполнялось в три этапа. На первом этапе определяли элементный анализ осколков ранящих снарядов с помощью приставки рентгеновского спектрального микроанализа INCA x-sight (Oxford Instruments, Англия) к растровому электронному микроскопу. Этап проводился на базе Физико-технического института им. А.Ф. Иоффе Российской академии наук, Санкт-Петербург (рис. 1).

Рис. 1. Сканирующая электронная микроскопия поверхности образцов осколков. В квадратах обозначены участки, в которых определялся элементный состав осколков.

а — образец 1; б — образец 2; в — образец 3.

На втором этапе выполняли цитологическое исследование осколков ранящих снарядов. Для изучения были выбраны 12 осколков, удаленных у раненых из головного мозга при выполнении им первичной хирургической обработки. Для цитологического исследования первым этапом выполняли подготовку осколков. Металлические осколки ранящих снарядов, удаленные из вещества головного мозга, тщательно отмывали в проточной воде и механически очищали от органических веществ, которые находились на их поверхности. После этого проводили снятие окислов с поверхности осколков с помощью металлической щеточки, затем повторно проводили промывку осколков в проточной воде, высушивали и после этого отправляли на исследование. Для определения состава и цитотоксичности ранящих снарядов были произвольно отобраны 3 ферромагнитных образца.

Тест на цитотоксичность осколков ранящих снарядов

Для исследования цитотоксичности использовали клеточную линию человека T98G (человек, глиобластома) (Институт цитологии, Санкт-Петербург). Клетки культивировались в CO₂-инкубаторе при 37 °C в увлажненной атмосфере, содержащей воздух и 5% CO₂ в питательной среде MEM (Modified Eagl’s Medium; Gibco), содержащей 1% незаменимых аминокислот, 10% (об/об) (Gibco) термический инактивированную фетальную бычью сыворотку (FBS; HyClone, США), 1% L-глутамина, 50 Ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина.

Для эксперимента использовали 96-луночный планшет. В каждую лунку вносили 5,0·10³ клеток. Клетки культивировали в течение 24 ч. За это время клетки прикрепились к поверхности лунки. Питательную среду из лунок удаляли и к прикрепившимся клеткам в лунке добавляли питательную среду, в которой предварительно выдерживали осколки в течение 1 нед. Клетки с добавленной средой культивировали дополнительно в течение 72 ч (рис. 2). По окончании инкубационного периода среду из лунок удаляли и к клеткам в лунках добавляли 50 мкл питательной среды с метил-тетразолиевым тестом (МТТ) (0,5 мг/мл — содержание МТТ). Далее клетки инкубировали в CO₂-инкубаторе в течение 2 ч при 37 °C. После удаления надосадочной жидкости образованные метаболически жизнеспособными клетками кристаллы формазана растворяли в диметилсульфоксиде (50 мкл/лунку) и переносили в чистые лунки, а затем измеряли оптическую плотность при 570 нм на планшетном спектрофотометре. Для расчета использовался анализ полиномиальной регрессии в программе Microsoft Excel.

Рис. 2. Результаты метил-тетразолиевого теста после 3 сут культивирования.

Тест на цитотоксичность титановых пластинок

На третьем этапе для сравнения с токсичностью осколков проводили исследование цитотоксичности образцов титана ВТ6 как наиболее часто применяемых при пластическом замещении дефектов черепа. Образцы были представлены в виде пластинок с размерами граней 3×5 мм. Эти исследования также проводили на клеточной линии человека T98G (человек, глиобластома) в институте цитологии РАН, Санкт-Петербург. Методика выполнения исследования была аналогичной исследованию на токсичность осколков ранящих снарядов. На рис. 3 представлена пробирка с титановыми пластинками.

Рис. 3. Внешний вид пробирки с титановыми образцами после 1 нед инкубирования в питательной среде.

Как видно на рис. 3, цвет питательной среды не изменился, среда осталась прозрачной, что свидетельствует об отсутствии окислительных процессов на поверхности титановых образцов в течение данного срока инкубирования.

Результаты

Результаты исследования элементного состава осколков ранящих снарядов представлены в таблице.

Результаты элементного анализа осколков

Все исследуемые осколки представляли собой сплавы различных металлов и других химических элементов. Разные осколки содержали в своем составе в основном кислород в виде оксидов, а также железо (образцы №2—3) или медь (образцы №1, 3). Во всех образцах также было выявлено большое количество углерода. В образце №3 присутствовал мышьяк.

При получении результатов второго этапа исследования было установлено, что морфология клеток в присутствии питательной среды после инкубирования с осколками существенно отличается от морфологии клеток, культивируемых в стандартных условиях. Данные оптической микроскопии клеток линии T98G представлены на рис. 4. На рисунке видно, что клетки в образцах со средой после инкубирования с осколками имеют округлую форму и их количество существенно уступает количеству клеток в контрольном образце, где клетки хорошо распластаны, имеют вытянутую форму и сформировали монослой.

Рис. 4. Оптическая микроскопия клеток линии T98G.

а — контроль, ×10; б — образец №1, ×10; в — образец №2, ×10; г— образец №3, ×10.

Жизнеспособность клеток, культивируемых в присутствии питательной среды, также оказалась существенно ниже жизнеспособности клеток, культивируемых в стандартных условиях, даже несмотря на различия в элементном составе образцов (таблица). Все образцы оказывали цитотоксическое действие на культивируемые клетки, существенно снижая их пролиферативный потенциал.

Результаты цитологического исследования титановых образцов представлены на рис. 5.

Инкубирование титановых образцов в питательной среде не оказывало цитотоксического эффекта на клетки линии T98G.

На рис. 5 видно, что клетки рядом с титановыми образцами имели нормальную морфологию, вытянутые клетки сформировали монослой. Жизнеспособность клеток, культивируемых в присутствии питательной среды после инкубирования с титановыми образцами незначительно уступала контролю (рис. 6). Эти незначительные отличия находились в пределах погрешности.

Рис. 5. Результаты цитологического исследования титановых образцов.

а — контроль, ×4; б — контроль, ×10; в — контроль, ×20; г — титан, ×4; д — титан, ×10; е — титан, ×20.

Рис. 6. Результаты метил-тетразолиевого теста после 3 сут культивирования в питательной среде после инкубирования титановых образцов.

Контроль — клетки, культивируемые в стандартной питательной среде.

Обсуждение

Изучение воздействия металлических осколков на ткани человеческого организма в ближайший и отдаленный период после ранения является важным и актуальным, т.к. позволяет прогнозировать развитие осложнений, связанных с токсическим действием этих инородных тел на ткани организма и, в частности, на головной мозг.

Появляется все больше доказательств того, что некоторые металлы, длительно находящиеся в организме, могут проникать через гематоэнцефалический барьер из крови в межклеточное пространство мозга и нарушать баланс эндогенных металлов, накапливаться в мозге и нарушать нормальную функцию нейронов [11, 12].

По некоторым оценкам, глиальные клетки составляют около 80% клеток человеческого мозга и активно вовлечены в гомеостаз ЦНС, участвуя в подавляющем большинстве нейробиологических процессов [13]. Это делает данные клетки весьма интересной моделью для изучения нейротоксичности металлических наночастиц, поскольку нарушения в работе глиальных клеток могут привести к нарушению целостности гематоэнцефалического барьера, нейронной пластичности и миелинизации, а также спровоцировать развитие нейродегенеративных заболеваний. Кроме того, следует отметить, что информация о влиянии металлических наночастиц на глиальные клетки весьма скудна; поэтому в данной работе мы решили изучить потенциальную нейротоксичность осколков в отношении глиальных клеток. Линия клеток человеческой глиобластомы T98G является стандартной клеточной линией, которая используется для оценки цитотоксичности металлических наночастиц [14, 15]. В данном исследовании мы приняли решение использовать именно эту клеточную линию как стандартную воспроизводимую модель глиальных клеток человека.

В исследуемых нами образцах свинца обнаружено не было. Даже алюминий, который был обнаружен в двух из трех образцов, обладает очень низкой острой токсичностью, после хронического воздействия из различных источников окружающей среды мог являться причиной возникновения болезни Альцгеймера и рака молочной железы [16].

Известно, что тяжелые металлы, такие как мышьяк (As), свинец (Pb), ртуть (Hg), алюминий (Al) и кадмий (Cd), часть из которых обнаружена в исследуемых образцах осколков, могут быть токсичными даже при низких концентрациях; кроме того, они могут оказывать значительное влияние на развитие и прогрессирование нейродегенеративных заболеваний в головном мозге человека [17, 18]. Поэтому даже их незначительное количество в осколках, а для образца №3 содержание мышьяка составляло 0,32%, и возможное высвобождение его в кровь и лимфу может оказывать токсическое влияние на организм. Комбинация металлов также может негативно влиять на головной мозг. Даже нетоксические концентрации отдельных металлов в организме могут заметно усиливать индуцированную другими металлами гибель нейронов, и, как следствие, синергическая нейротоксичность комбинации металлов может вызывать такие неврологические заболевания, как сосудистая деменция, болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона [19]. Также свинец, мышьяк, кадмий и ртуть могут вызывать нарушения гомеостаза жизненно важных для организма человека металлов: железа, меди и цинка, — потенциально провоцируя развитие нейродегенеративных заболеваний [17].

Таким образом, сохранение фрагментов металла в мозге пострадавшего может играть неблагоприятную роль в развитии последствий огнестрельных ранений черепа и головного мозга. Как видно из результатов элементного анализа, все исследованные осколки состоят из множества химических элементов, сплавов различных металлов. Все осколки в питательной среде выделяют токсичные окислы металлов, значительно снижающие жизнеспособность окружающих тканей, независимо от элементного состава исследованных осколков. Принимая во внимание, что наше исследование носит пилотный характер, взаимодействие между различными металлами и их сплавами и головным мозгом требует дальнейшего изучения.

Заключение

Совершенствование системы оказания помощи раненым с огнестрельными ранениями черепа и головного мозга приводит к увеличению количества выживших пострадавших — носителей внутричерепных металлических осколков. Если неврологические последствия ранений часто встречаются в этой группе пациентов, то симптомы нейротоксичности металлических инородных тел могут быть завуалированными и трудно идентифицируемыми. Экспериментально полученные данные о нейротоксичности современных ранящих снарядов могут служить основанием для более активной тактики, направленной в том числе на удаление внутричерепных инородных тел металлической плотности с широким применением различных систем нейронавигации.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Орлов В.П., Нащекина Ю.А.

Сбор и обработка материала — Васильева Н.К., Мирзаметов С.Д.

Анализ данных — Нащекин А.В., Иванькова Е.М.

Написание текста — Орлов В.П., Никонов П.О.

Редактирование — Мартынов Б.В., Свистов Д.В.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Комментарий

Работа посвящена определению состава и токсичности металлических осколков при минно-взрывных и осколочных черепно-мозговых ранениях. В сравнении с имплантатами из титана показано, что осколки оказывают выраженное токсическое воздействие на клетки модели глиобластомы. С позиций биологии, это исследование можно расценивать как пилотное с выбором адекватных моделей для анализа. Но главным в нем является выявление факта токсического воздействия материала осколков на окружающие клетки, что заставляет вновь вернуться к обсуждению существующей концепции необходимости оставления глубинно расположенных инородных тел в мозге. Безусловно, при создании взрывных устройств не думают о безопасности сплава, а подчас, наоборот, увеличивают химическую и биологическую агрессивность осколков. Поэтому сравнительный анализ авторов в данном пилотном исследовании подводит доказательную базу под необходимость рассмотрения вопроса операционного удаления боевых металлических инородных тел из полости черепа.

Г.В. Павлова (Москва)