Рыжова М.В.

ФГБУ "НИИ нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко" РАМН, Москва

Шайхаев Е.Г.

ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздрава России, ул. Профсоюзная, 86, Москва, Россия, 117997

Казарова М.В.

ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздрава России, ул. Профсоюзная, 86, Москва, Россия, 117997

Телышева Е.Н.

ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздрава России, ул. Профсоюзная, 86, Москва, Россия, 117997

Шишкина Л.В.

ФГБНУ «НИИ нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко», Москва, Россия

Шибаева И.В.

ФГАУ «НМИЦ нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко» Минздрава России, ул. 4-я Тверская-Ямская, 16, Москва, Россия, 125047

Шугай С.В.

ФГАУ «НМИЦ нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко» Минздрава России, ул. 4-я Тверская-Ямская, 16, Москва, Россия, 125047

Воронина Е.И.

Автономная некоммерческая организация «Региональный центр высоких медицинских технологий», Новосибирск, Россия; Новосибирский государственный медицинский университет, Новосибирск, Россия

Снигирева Г.П.

ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздрава России, ул. Профсоюзная, 86, Москва, Россия, 117997

Спектр генетических нарушений в анапластических астроцитомах и анапластических олигодендроглиомах

Журнал: Журнал «Вопросы нейрохирургии» имени Н.Н. Бурденко. 2017;81(6): 26-31

Просмотров : 123

Загрузок : 2

Как цитировать

Рыжова М. В., Шайхаев Е. Г., Казарова М. В., Телышева Е. Н., Шишкина Л. В., Шибаева И. В., Шугай С. В., Воронина Е. И., Снигирева Г. П. Спектр генетических нарушений в анапластических астроцитомах и анапластических олигодендроглиомах. Журнал «Вопросы нейрохирургии» имени Н.Н. Бурденко. 2017;81(6):26-31. https://doi.org/10.17116/neiro201781626-31

Авторы:

Рыжова М.В.

ФГБУ "НИИ нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко" РАМН, Москва

Все авторы (9)

Как известно, гистологическая верификация опухолей ЦНС имеет некоторые ограничения: морфолог, анализируя операционный материал, может получить данные, не совпадающие с данными МРТ. В настоящее время активно развивается новое направление в современной медицине — молекулярно-генетическая диагностика, результаты которой, в частности, нашли отражение и в новой классификации опухолей ЦНС ВОЗ, где выделена особая форма, объединяющая астроцитарные опухоли Grade II—IV — диффузная срединная глиома, характеризующаяся наличием мутации К27М в гене Н3F3A [1, 2]. Также в новой классификации впервые произошло объединение диффузных глиом Grade II—IV с астроцитарными и олигодендроглиальными гистологическими особенностями в одну группу в зависимости от наличия или отсутствия мутации гена IDH1 [2]. Таким образом, исследование генетики опухолей дополняет гистологическую верификацию, что позволяет более точно определять диагноз и прогноз заболевания.

Принимая во внимание, что опухоли ЦНС характеризуются множеством генетических и эпигенетических нарушений, поиск и идентификация генов, непосредственно вовлеченных в канцерогенез, позволит совершенствовать дифференциальную диагностику заболевания и соответственно улучшить результаты лечения.

Цель настоящей работы — сравнительное молекулярно-генетическое исследование двух типов злокачественных глиом: анапластической астроцитомы и анапластической олигодендроглиомы и сопоставление выявленных изменений с клинико-морфологическими данными. Для этого были проанализированы следующие молекулярно-генетические параметры: точковые мутации в 132 кодоне гена IDH1, точковые мутации в 5—8 экзонах гена TP53, точковые мутации в 9, 14 и 29 экзонах гена ATRX, коделеция 1p19q, статус метилирования гена MGMT.

Материал и методы

Материалом для исследования послужили образцы опухолевой ткани, полученные от 43 пациентов с диагнозами «анапластическая астроцитома» или «анапластическая олигодендроглиома». Все пациенты были оперированы в НИИ нейрохирургии им. Н.Н. Бурденко и затем прошли лучевую терапию в РНЦ рентгенорадиологии в период с 2005 по 2015 гг. В 2016 г. в НИИ нейрохирургии им. Н.Н. Бурденко совместно с коллегами из НГМУ был проведен повторный пересмотр и обсуждение биопсий, установленные ранее гистологические диагнозы подтверждены. Клинические данные по включенным в исследование пациентам представлены в табл. 1.

Таблица 1. Клинико-морфологическая характеристика исследуемой группы пациентов

Образцы опухолевой ткани были предварительно депарафинизированы с помощью ксилола и спирта. Выделение ДНК проводили с помощью комплекта реагентов Ускоренная пробоподготовка (ООО «Лаборатория Изоген», Россия).

Амплификацию методом ПЦР 132 кодона гена IDH1, 5—8 экзонов гена TP53, 9, 14, 29 экзонов гена ATRX проводили с помощью набора реактивов GenPak PCR Core (ООО «Лаборатория Изоген», Россия). Для секвенирования методом Сенгера полученных пцр-продуктов использовали набор реактивов Big Dye Terminator v 3.1 cycle sequencing kit («Applied Biosystems», США), непосредственно анализ проводили на генетическом анализаторе Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer.

Для оценки статуса метилирования промоутерной области гена MGMT использовали набор ЭпиГенТест-MGMT (ЗАО «Евроген», Россия).

Определение коделеции 1p/19q в гистологических образцах опухолей проводили с помощью набора ДНК-зондов Vysis LSI 1p36/LSI 1q25 и LSI 19q13/19p13 Dual Color Probe. Для оценки результатов анализа применяли критерии, рекомендованные ASCO в 2013 г.

Результаты

Мутации гена TP53 выявлены в 16 (37%) образцах опухолей: в экзоне 5 выявлено 3 мутации — c. 488A>G (p.Tyr163Cys); c.428T>G (p. V143G) и с. 376_378 delTAC (p. 126 delY); в экзоне 6 выявлено также 3 мутации — c. 652 G>A (p. V218M); c. 668 C>T (p. P223L) и с. 652_654 GTG (p. 218delV); в экзоне 7 выявлено 2 мутации: c. 733G>A (p. G245S) и c. 735G>A (p. G245D); в экзоне 8 выявлено больше всего мутаций —7 мутаций c. 817C>T (p. R273C) и по одной мутации c. 810T>G (p. F270L), с. 799C>T (p. R267W), c. 817C>T (p. R273C), с. 843С>G (p. D281E) и с. 844C>T (p. R282W) (рис. 1).

Рис. 1. Анализ мутаций в 8 экзоне гена TP53 с помощью секвенирования методом Сенгера. а — обнаружение мутации c. 817C>T (p. R273C) (сдвоенный пик отмечен стрелкой), б — вариант нормы.

Мутации гена IDH1 выявлены в 25 образцах опухолей (58%): преимущественно выявлен вариант p. R132H (c. G395A) – 22 случая; в двух образцах была выявлена мутация p. R132S (c. C394A) и в 1 случае - p. R132G (c. C394G) (рис. 2).

Рис. 2. Анализ мутаций в 132 кодоне гена IDH1 с помощью секвенирования методом Сенгера. а — обнаружение мутации p. R132H (c. G395A) (сдвоенный пик отмечен стрелкой), б — вариант нормы.

Мутация гена ATRX выявлена в 9 (21%) случаях: в одном образце выявилось 2 мутации, затрагивающие экзоны 9 и 14 — в экзоне 9 вариант c. 2648_2649delAA и в экзоне 14 — вариант c. 4261C>T (p. Q1421X); помимо этого в экзоне 9 выявлена мутация с. 1149_1152delCAG, а в экзоне 14 — c. 4276С>T (p. R1426X). В экзоне 29 было выявлено 6 мутаций: 2 мутации c.6338_6341delTTAT и по одной мутации с. 6491G>A (p. R2164K), с. 6467A>G (p.Q2156R), с. 6338T>C (p. F2113S), c. 6470 C>G (p. T2157S) c. 6488A>C (p. Y2163S).

Метилирование промоутера гена MGMT выявлено в 20 (46%) образцах опухолей.

Коделеция 1p19q была обнаружена в 8 (17%) образцах опухолей.

В табл. 2 представлены

Таблица 2. Сравнение генетических нарушений и клинико-морфологических особенностей
выявленные генетические изменения в исследуемых генах у пациентов с анапластической астроцитомой и анапластической олигодендроглиомой, а также их распределение в зависимости от локализации опухоли, пола и возраста обследуемых.

Обсуждение

В исследование были включены две гистологические разновидности злокачественных диффузных глиом — анапластическая астроцитома и анапластическая олигодендроглиома. Мы не включили в работу случаи смешанных олигоастроцитарных опухолей, пытаясь найти четкие генетические различия между астроцитарными глиомами и олигодендроглиальными опухолями.

Исходя из собственного опыта, мы можем утверждать, что привычка морфологов к гипердиагностике олигоастроцитом достаточно распространена и слегка варьирует от одного диагностического центра к другому. Данная ситуация нашла свое отражение в новой классификации ВОЗ опухолей ЦНС, содержащей четкое определение, согласно которому участок олигодендроглиальной гистологии среди диффузной астроцитомы вполне совместим с диагнозом «диффузная астроцитома» или «анапластическая астроцитома» при отсутствии коделеции 1p19q [2]. Кроме того, некоторые исследователи [3], опираясь на молекулярные особенности диффузных глиом, склоняются к мысли о том, что нозологическая единица «олигоастроцитома» не существует, что за астроцитарную часть «олигоастроцитомы» принимается реактивный астроцитарный компонент.

Исследовав мутационный статус, эпигенетические события и количественные изменения на хромосомах в 29 анапластических астроцитомах и 14 анапластических олигодендроглиомах, мы увидели четкую связь этих опухолей с возрастом, локализацией и выявленными нарушениями. Обращает на себя внимание отсутствие изучаемых нарушений в опухолях неполушарной локализации, в то время как в литературе [2, 4] описаны единичные случаи злокачественных IDH1-мутантных диффузных глиом с локализацией в мозжечке. Большинство из выявленных нами генетических нарушений возникали в опухолях у молодых людей 30—40-летнего возраста, преимущественно поражавших лобные доли. Кроме того, нередко были сочетания нескольких генетических нарушений в одном образце опухоли. Имелись некоторые различия в частоте возникновения генетических нарушений в анапластических астроцитомах и в анапластических олигодендроглиомах: в олигодендроглиальных опухолях чаще возникали мутации генов IDH1 (64% против 55% в анапластических астроцитомах), причем возраст пациентов с мутантными опухолями в этом случае был гораздо старше — можно было видеть мутации в анапластических олигодендроглиомах у пациентов старше 50—60 лет, среди IDH1-мутантных анапластических астроцитом возраст пациентов не превышал 50 лет; метилирование гена MGMT также чаще встречалось в анапластических олигодендроглиомах (71% по сравнению с 34% в анапластических астроцитомах); в то время как мутация гена TP53 чаще развивалась в анапластических астроцитомах (41%) и только приблизительно в 1/3 (28%) всех анапластических олигодендроглиом.

Наблюдались и существенные молекулярные отличия анапластических астроцитом от анапластических олигодендроглиом: коделеция 1p19q была выявлена в олигодендроглиальных опухолях, в то время как мутация гена ATRX (за единственным исключением) — только в анапластических астроцитомах. Единственный необъяснимый случай сочетания мутации ATRX и коделеции 1p19q был выявлен в анапластической олигодендроглиоме, развившейся в височной доле у женщины 66 лет с длительным дооперационным периодом, которая в течение 2 лет наблюдалась по поводу внутримозговой опухоли. Также в опухоли этой пациентки были выявлены мутация в гене IDH1 и метилированный ген MGMT. Повторно пересматривая гистологические препараты на предмет наличия астроцитарного компонента, мы подтвердили диагноз «анапластическая олигодендроглиома», не найдя гистологических признаков астроцитарной дифференцировки в присланном на исследование материале. На сегодняшний день мы не готовы объяснить сочетание мутации ATRX и коделеции 1p19q в геноме опухоли, что, возможно, или является артефактом, или это опухоль, имеющая гистологическое строение, совместимое с диагнозом «анапластическая олигодендроглиома», но с молекулярными особенностями все же существующей олигоастроцитомы?

За исключением вышеописанного случая, полученные нами данные вполне согласуются с данными, полученными другими авторами [5—10], которые рекомендуют иммуногистохимическое исследование мутантного протеина ATRX с помощью коммерчески доступных антител (HPA001906, SigmaAldrich; anti-human ATRX antibody ab97508, Abcam в разведении 1:800) как простой и надежный способ не только исследования мутационного статуса данного гена, но и для отличия олигодендроглиальных опухолей от астроцитом [5, 6, 11—15], что представляется более удобным, чем кропотливое исследование гена ATRX, повреждение которого может затрагивать большое количество экзонов.

Иммуногистохимическое исследование также может быть рекомендовано и как первый этап поиска мутаций в гене IDH1. Ранее мы уже рекомендовали использовать для этого исследования коммерчески доступное антитело Anti-Human IDH1 R132H astrocytoma and oligodendroglioma tumor cell marker mouse monoclonal antibody фирмы «Dianova» клон H09 в разведении 1:20 [16], с помощью которого можно отлично выявлять мутацию гена IDH1 — R132H, на долю которой приходится приблизительно 90% от общего количества выявляемых мутаций в гене IDH1. Для выявления оставшихся 10% необходимо выполнять прямое секвенирование кодона 132 гена IDH1: в нашем исследовании мутация с заменой аргинина в позиции 132 на гистидин (R132H) выявлена в 88%; мутации с другими заменами — аргинин в позиции 132 на серин (R132S) и аргинин в позиции 132 на глицин (R132G) были обнаружены в 12% случаев. В соответствии с рекомендациями ВОЗ, желательно исследовать кодон 172 гена IDH2 [2].

Что касается выявления мутации гена TP53, то здесь речь может идти только о секвенировании. Иммуногистохимическая ядерная экспрессия TP53 нечетко коррелирует с выявлением мутации гена TP53 [9]. Предпочтительными методами исследования статуса метилирования промотора гена MGMT и коделеции 1p19q являются соответственно метилспецифическая полимеразная цепная реакция (МПЦР), бисульфидное пиросеквенирование, требующее 0,5—1 мкг ДНК и флуоресцентная гибридизация in situ и микросателлитный анализ потери гетерозиготности [17].

Заключение

При гистологической картине смешанной олигоастроцитомы (анапластическая олигоастроцитома) для уточнения гистологического диагноза рекомендуется проводить исследование мутации гена ATRX и коделеции 1p19q с применением зондов Vysis («Abbott») или Kreatech. Исследование мутационного статуса генов IDH1 и ATRX целесообразнее начинать с иммуногистохимического исследования; при отрицательной экспрессии IDH1 желательно выполнить исследование мутации этого гена в кодоне 132 методом прямого секвенирования для выявления точковых мутаций, отличных от R132H. Также необходимо исследовать и кодон 172 гена IDH2. В алгоритм диагностики полушарных злокачественных глиом следует включить изучение мутационного статуса генов BRAF и H3F3A, что, безусловно, улучшит качество молекулярно-гистологической диагностики опухолей и дальнейшего лечения с использованием таргетных препаратов [18, 19]. Согласно рекомендациям [17, 20], при злокачественных полушарных опухолях у взрослых при возможности необходимо изучать статус метилирования промоутера гена MGMT. Вероятно, что в ближайшее время список включенных в исследование генов при диффузных глиомах может пополниться генами TERT, CIC и FUBP1, диагностическое и прогностическое значение которых широко изучается в настоящее время [10, 11, 13, 15, 18, 20—24].

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail: mrizhova@nsi.ru

Комментарий

Статья посвящена одной из актуальных проблем современной онкологии — дифференциальной диагностике опухолей головного мозга. Авторы проанализировали молекулярно-генетические особенности анапластических астроцитом и олигодендроглиом в серии из 43 наблюдений. Анализ включал исследование точковых мутаций в 132 кодоне гена IDH1, точковых мутаций в 5—8 экзонах гена TP53, точковых мутаций в 9, 14 и 29 экзонах гена ATRX, коделецию 1p19q, статус метилирования гена MGMT. Полученные авторами на небольшом материале, но очень убедительные данные позволили рекомендовать при уточнении диагноза проведение молекулярно-генетического анализа с применением данных маркеров, причем с учетом гистологических и иммуногистохимических особенностей опухоли согласно предложенному алгоритму исследования. По мнению авторов, дальнейшие исследования могут внести определенные коррективы, связанные в первую очередь с включением других молекулярно-генетических маркеров, диагностическое и прогностическое значение которых широко изучается в настоящее время.

Работа выполнена на современном уровне с применением высокочувствительных методов исследования (ПЦР, секвенирование по Сенгеру), которые в то же время вполне доступны для использования лабораториями учреждений практического здравоохранения.

Текст статьи написан хорошим научным языком, иллюстрирован двумя таблицами и двумя рисунками. Результаты представлены четко и понятно. Хорошо представлен раздел «Обсуждение», в котором авторы излагают свое видение рассматриваемой в статье проблемы, касающейся сложности диагностики опухолей головного мозга. Библиографический список вполне достаточен, включает 23 работы, обращает на себя внимание то, что все статьи изданы за последние 5 лет.

Представленная работа, несомненно, актуальна и имеет большое научно-практическое значение.

А.Х. Бекяшев ( Москва)

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail