Spinal mechanisms of neuroplasticity induced by neuromidin in treatment of traumatic neuropathies

Zhivolupov S.A.; Onishchenko L.S.; Rashidov N.A.; Samartsev I.N.; Jakovlev E.V.

doi:https://doi.org/10.17116/jnevro20181182158-64

В соответствии с современной доктриной неврологии, нейропластичность является ключевым фактором, определяющим эффективность компенсаторно-восстановительных процессов при лечении заболеваний и травм нервной системы. Однако даже новейшие медицинские технологии не позволяют системно контролировать основные механизмы нейропластичности в клинических условиях. Тем не менее модуляция архитектоники соматосенсорных проекционных зон в коре головного мозга была первоначально изучена при периферической сенсорной депривации (деафферентация при местной анестезии), травмах периферических нервов, ампутации конечностей [1, 2]. В связи с этим травматическая аксонотомия считается одной из наиболее адекватных моделей для изучения нейропластичности применительно к различным структурам нервной системы.

Цель настоящего исследования — анализ спинальных нейропластических механизмов терапевтической эффективности антихолинэстеразного препарата нейромидин (оригинальная лекарственная форма ипидакрина), широко используемого в клинической практике для лечения заболеваний и травм нервной системы с доказанной эффективностью.

Материал и методы

Моделирование травматической аксонотомии осуществлялось на беспородных половозрелых крысах массой 150—200 г с помощью экспериментального нейротмезиса хирургическим путем, состоящим из нескольких этапов. На первом этапе производили разрез кожи по проекционной линии левого седалищного нерва крысы и его отграничение от остальных тканей; на втором — пересекали седалищный нерв на уровне верхней трети бедра с созданием диастаза; на третьем — накладывали эпиневральный шов в месте пересечения седалищного нерва и ушивали рану. Экспериментальные исследования на животных проводились в соответствии с постановлениями Министерства образования и науки РФ от 30.11.07 и Рособрнадзора от 22.12.07.

Подопытные животные были разделены на две равновеликие группы (по 3 крысы в группе): крысам основной группы проводилось лечение нейромидином путем внутримышечных инъекций в дозе 0,035 мг (эквивалентно дозе препарата при применении в клинической практике) ежедневно в течение 30 сут, крысы контрольной группы лечения не получали.

Материал для электронно-микроскопического исследования забирали через 30 сут после начала эксперимента из переднерогового сегмента поясничного отдела спинного мозга животного и подготавливали по стандартным методикам [3]. Светооптически изучали полутонкие эпон-аралдитовые срезы, окрашенные по методу Ниссля толуидиновым синим; затем с этого же уровня изготавливали ультратонкие срезы, контрастировали их цитратом свинца по Рейнольдсу с уранилацетатом, фотографировали в электронном микроскопе, оцифровывали и описывали.

Результаты

Через 30 сут от начала эксперимента у животных обеих групп наблюдались полиморфные разнонаправленные изменения всех структур поясничного отдела спинного мозга: нейронов, олигодендроцитов, миелиновых волокон, нейропиля, сосудов. При этом у животных контрольной группы только около половины нейронов были нормохромными и имели умеренно активные ядра и ядрышки, а также цитоплазму с типичным наполнением органоидов. Большинство нормохромных нейронов (рис. 1)

Рис. 1. Нормохромный нейрон спинного мозга у животных контрольной группы. Здесь и на рис. 2, 5—7: Я — ядро; здесь и на рис. 4—6: Н — нейрон.

обладали небольшими размерами и содержали очень мало митохондрий. Часть митохондрий была вакуолизирована, часть имела размытую структуру. Обращало на себя внимание повышенное содержание плотных митохондрий. Гранулярная эндоплазматическая сеть была умеренно развита, комплекс Гольджи определялся с трудом. Обнаружены также и гиперхромные нейроны в небольшом количестве, и они нередко содержали крупные вакуоли, заполненные митохондриями без крист и везикулами неизвестного генеза. В гиперхромных нейронах митохондрий было меньше, чем в нормохромных; а структура их была размытой. Вышеуказанные изменения нейронов отражают состояние их сниженной функциональной активности.

Некоторые олигодендроциты поясничного отдела спинного мозга, выполняющие трофическую функцию, у крыс контрольной группы (без лечения) имели нормальную структуру ядра и цитоплазму с умеренным набором органоидов. У незначительной части миелинообразующих олигодендроцитов встречались типичные ядра, реже — ядра с признаками начала апоптоза, а их цитоплазма часто содержала вакуолизированные митохондрии; в некоторых олигодендроцитах цитоплазма была дистрофически изменена по светлому типу (рис. 2).

Рис. 2. Дистрофически измененные спинальные олигодендроциты. а — олигодендроцит с типичным ядром; б — ядро олигодендроцита с признаками начала апоптоза; в — олигодендроцит с цитоплазмой, дистрофически измененной по светлому типу. Здесь и на рис. 3—9: МВ — миелиновые волокна; здесь и на рис. 5, 7: ОД — олигодендроциты.

Миелиновые волокна имели как сохранные осевые цилиндры, так и дистрофически измененные, иногда по темному, но чаще по светлому типу. В миелиновой оболочке наблюдались расслоение слипшихся ламелл и их фрагментация. Встречались миелиновые волокна с дистрофией осевого цилиндра и признаками демиелинизации (рис. 3).

Рис. 3. Миелиновые волокна на срезе спинного мозга. а — миелиновые волокна с дистрофией осевых цилиндров по темному типу (стрелки); б — миелиновые волокна с дистрофией осевых цилиндров по светлому типу; в — в центре снимка безмиелиновое волокно с большим количеством митохондрий плотной структуры и неправильной формы (стрелка).

Безмиелиновые волокна имели умеренную либо сильно выраженную дистрофию осевых цилиндров по светлому типу и нередко были заполнены митохондриями неправильной формы и с плохо различимым матриксом и кристами.

В капиллярах спинного мозга эритроциты часто располагались в виде монетных столбиков; также встречались нейтрофилы и набухшие эндотелиоциты, которые свидетельствовали о воспалительном процессе. Цитоплазма перицитов также была дистрофически изменена, а астроцитарные «ножки», как правило, были прозрачными либо отсутствовали (рис. 4).

Рис. 4. Капилляры спинного мозга. а — «монетные столбики» из эритроцитов; б — свободные эритроциты вблизи сосудов и измененные миелиновые волокна. Вокруг сосудов — прозрачные астроцитарные «ножки». Здесь и на рис. 9: Э — эритроцит.

Миелиновые волокна вблизи сосудов также имели признаки демиелинизации и слипания ламелл, а в нейропиле встречались свободные эритроциты, что являлось признаком локальных нарушений гематоэнцефалического барьера.

У крыс основной группы среди нейронов спинного мозга наблюдались клетки со светлыми ядрами, имеющими типичную структуру кариоплазмы, которые можно отнести к нейронам в активном функциональном состоянии (рис. 5, а).

Рис. 5. Нейроны спинного мозга. а — нейрон со светлым ядром, находящийся в умеренном морфофункциональном напряжении; б — нейрон с сильной вакуолизацией цитоплазмы (блеббинг); в — нейрон со складчатым ядром в окружении олигодендроцитов. Ядр — ядрышко; здесь и на рис. 6: КГ — комплекс Гольджи.

Кроме них и в гораздо большем количестве, чем у животных контрольной группы, встречались нейроны с полным набором органелл в цитоплазме, а также сильной вакуолизацией цитоплазмы (блеббингом). Эти нейроны обычно относят к клеткам, находящимся в морфофункциональном напряжении (см. рис. 5, б). И, наконец, выявлялись нейроны, имевшие сильно измененные ядра, в которых наблюдалась совершенно нетипичная структура и локализация хроматина в кариоплазме, а также была изменена структура цитоплазмы: могла быть плотной либо вакуолизированной (см. рис. 5, в). Рядом с ними находились трофические олигодендроциты в разном функциональном состоянии.

Среди крупных нейронов часто встречались темные клетки с плотной цитоплазмой, но при этом имевшие нетипично расширенные цистерны комплекса Гольджи (рис. 6, а).

Рис. 6. Крупные нейроны спинного мозга. а — комплекс Гольджи с расширенными цистернами; б — свободные эритроциты. Э — эритроцит вне сосуда, вблизи нейрона.

Этих нейронов было примерно ¼ среди всех клеток, и их следует отнести к клеткам с незначительно сниженной функциональной активностью. Вблизи нейронов не всегда находились трофические олигодендроциты. Интересной особенностью нейронов в состоянии сниженной функциональной активности было заполнение их отростков многочисленными митохондриями с плохо различимой внутренней структурой. Кроме темных малоактивных нейронов, встречались нейроны с дистрофией цитоплазмы по светлому типу, т. е. с цитоплазмой, не содержащей каких-либо органелл, и у таких нейронов также была изменена кариоплазма ядра, которая не имела типичного расположения хроматина. Изредка вблизи нейронов или в нейропиле встречались свободные эритроциты (вне сосуда), что подтверждало факт нарушения целостности гематоэнцефалического барьера (см. рис. 6, б).

После лечения нейромидином олигодендроциты были представлены как клетками с типичным строением ядра и цитоплазмы, так и клетками в состоянии повышенной функциональной активности. У первых хроматин располагался типичным образом, а цитоплазма имела полный набор органелл. У второго типа олигодендроцитов ядра могли иметь признаки апоптоза, а цитоплазма была уплотнена (рис. 7, а,

Рис. 7. Олигодендроциты в различном морфофункциональном состоянии. а — олигодендроцит с нормальной морфологией ядра и отростком; б — олигодендроцит с ядром, имеющим начальные признаки апоптоза, и плотной цитоплазмой; в — пролиферация олигодендроцитов.

б); также встречались олигодендроциты в состоянии пролиферации (см. рис. 7, в).

Нейропиль также имел полиморфную картину. Кроме нейропиля обычного вида, содержащего безмиелиновые и миелиновые волокна, изредка встречался нейропиль разреженного вида (рис. 8 а,

Рис. 8. Нейропиль с заполнением волокнами различной плотности. а — нейропиль со скоплением миелиновых волокон, имеющих хорошие осевые цилиндры; б — нейропиль с небольшим количеством миелиновых и безмиелиновых волокон; в — безмиелиновое волокно с большим количеством митохондрий. М — митохондрии.

б) и иногда совсем прозрачный. Очень важно отметить, что у животных основной группы (с лечением нейромидином) осевые цилиндры миелиновых волокон имели, как правило, достаточное количество нейрофибрилл и упорядоченное расположение. При этом в самом миелине не наблюдалось особой регулярности расположения миелиновых фибрилл, и миелиновые оболочки вследствие этого имели «слипшийся» вид. В некоторых не совсем сохранных безмиелиновых волокнах выявлялось необычно большое скопление митохондрий (см. рис. 8, в). В нейропиле животных, не получавших лечения, изменения миелиновых волокон встречались чаще и были более разнообразными и выраженными.

После лечения нейромидином в миелиновых волокнах участки разволокнения встречались редко. По сравнению с контрольной группой обращало на себя внимание различие в структуре перехватов Ранвье. Так, по ходу волокон они обычно имели обычную структуру насечек Шмидта—Лантермана и умеренную длину самого перехвата. В то же время наблюдались «открытые» участки миелиновых волокон, на краю которых находились типично оформленные перехваты Ранвье (рис. 9, а,

Рис. 9. Миелиновые волокна. а — два перехвата Ранвье (стрелки); б — перехват Ранвье на краю волокна (стрелка). ПР — перехват Ранвье.

б).

Единичные олигодендроциты располагались вблизи капилляров, входя, таким образом, в состав гематоэнцефалического барьера вместо астроцитов. Последние вблизи сосудов встречались редко, и их астроцитарные «ножки» (отростки) были прозрачными.

Кроме того, через 1 мес лечения ипидакрином в нейропиле обнаруживались проявления синаптогенеза: единичные созревающие аксодендритические и двухполюсные дендро-дендритические синапсы типичной структуры.

Обсуждение

Травматический аксонотмезис вызывает существенные реактивные изменения на различных этажах ЦНС, которые включают воспалительные, дисциркуляторные и нейропластические процессы; последние изучены в первую очередь на церебральном уровне (реорганизация коры головного мозга). Данные изменения зависят от давности травмы и динамики неврологических расстройств и подтверждены с помощью магнитно-резонансной (МР) морфометрии и МР-трактографии [4]. В частности, установлено, что в нейропластические процессы в зависимости от динамики неврологического дефицита на различных сроках после травмы изначально вовлечены сенсорные и моторные зоны коры, вторичные моторные поля по Бродману, парацентральные области, в некоторой степени височная кора, а также кортикоспинальный тракт, малые (лобные) щипцы [2, 5, 6].

Спинальные механизмы нейропластичности изучены в значительно меньшей степени в виду методологических сложностей и отсутствия нейровизуализационных маркеров, хотя C. Garrison и соавт. [1] обнаружили двустороннее увеличение числа астроцитов после односторонней аксотомии, что являлось свидетельством активации нейроглии спинного мозга, а высвобождение астроцитами цитокинов увеличивало нейрональную возбудимость. Данное обстоятельство диктует необходимость уточнения характера патофизиологических процессов, лежащих в основе спинальной нейропластичности. Кроме того, определение их фармакологических модуляторов может способствовать оптимизации лечения больных с заболеваниями и травмами периферической нервной системы (ПНС), что определяет актуальность настоящего исследования.

Использование антихолинэстеразного средства нейромидин (оригинальный ипидакрин) в настоящем исследовании было обусловлено фармакологическим действием препарата, который оказывает непосредственное стимулирующее влияние на нейрональную возбудимость, проведение импульса по нервным волокнам, межнейрональным и нервно-мышечным синапсам ПНС и ЦНС, что прогнозирует его потенциально положительную роль в модуляции нейропластичности.

Полученные результаты свидетельствуют о положительном влиянии нейромидина на компенсаторно-восстановительные процессы, протекающие в спинном мозге при травматической аксонотомии. Сравнительный анализ нейроморфологических изменений на уровне спинного мозга у животных основной и контрольной групп показал наличие у нейромидина нейропротективной активности и модулирующего действия на спинальную нейропластичность: у крыс, в лечении которых использовался нейромидин, чаще встречались нормальные нейроны, а также нейроны, находящиеся в морфофункциональном напряжении; осевые цилиндры миелиновых волокон имели, как правило, достаточное количество нейрофибрилл и упорядоченное расположение; в нейропиле обнаруживались «активные» олигодендроциты, единичные созревающие аксодендритические и двухполюсные дендро-дендритические синапсы типичной структуры. Особого внимания заслуживает тот факт, что в спинном мозге у животных основной группы были обнаружены «активные» олигодендроциты; поскольку последние продуцируют гликопротеин J1−160/180 (janusin), который является модулятором активности астроцитов и конусов роста в ЦНС [7].

Аналогичные данные получены в исследовании M. Tohill и G. Terenghi [8], которые пришли к выводу, что спинальные нейропластические механизмы при нейротомии включают появление реактивных нейроглиальных клеток в соответствующих сегментах спинного мозга и формирование новых рецептивных полей за счет синаптической реорганизации нейронных ансамблей; а трансганглионарная дегенерация наблюдается на значительном протяжении ЦНС, но наиболее — в медиальной части 1—4 пластинок ипсилатерально на уровне заднего рога L₂—L₆, в пучках Голля и Бурдаха как на стороне травмы, так и на противоположной.

Таким образом, аксонотомия является пусковым фактором посттравматической нейропластичности, которая координирует компенсаторно-восстановительные процессы, определяющие исход повреждения. В основе спинальных механизмов нейропластичности лежат реорганизация клеточного пула и в первую очередь нейроглии, что позволяет предупредить глобализацию транссинаптической дегенерации и активизировать двигательные и чувствительные нейроны. Использование фармакологической модуляции на примере антихолинэстеразного препарата нейромидин позволяет интенсифицировать спинальные механизмы нейропластичности за счет активации трофических олигодендроцитов, что способствует увеличению выживаемости нейронов и ускоряет посттравматическую реорганизацию мотонейронного пула.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail: peroslava@yandex.ru