Отсроченный дебют симптоматической стадии FUS-протеинопатии у трансгенных мышей под действием димебона

Одной из форм молекулярной патологии, ассоциированной с развитием специфического поражения двигательных нейронов, характерного для бокового амиотрофического склероза (БАС), является нарушение метаболизма и функции ДНК/РНК-связывающего белка FUS. У больных с семейными формами БАС описан ряд мутаций в кодирующей части этого гена [1, 2]. У таких больных наблюдается изменение компартментализации белка FUS с перераспределением его из ядра в цитоплазму и формирование характерных FUS-реактивных включений неамилоидного типа. Основные физико-химические характеристики включений в совокупности с координированным прогрессированием нейродегенеративного процесса, соответствующей интенсивности накопления включений в поражаемых анатомических областях, позволяют классифицировать данный тип патологии как FUS-протеинопатию [3]. Среди генетических моделей FUS-протеинопатии [4] наиболее успешной является линия генетически модифицированных мышей FUS^1—513 [5], у которых развивается прогрессирующая FUS-протеинопатия с характерными признаками клинической картины БАС [5, 6]. Использование подобного типа животных моделей позволяет существенно оптимизировать разработку терапии БАС. Единственным рекомендованным для пациентов с БАС препаратом является рилузол (МНН: Riluzol), который не влияет на выраженность симптоматики, но может увеличивать продолжительность жизни больных до 10% [7, 8]. В настоящее время 55 соединений и 1 вакцина находятся на разных стадиях клинических испытаний, и ожидается, что их число в ближайшее время возрастет [9, 10].

Ранее было показано, что отечественный препарат димебон^​1​᠎ способен замедлять развитие различных протеинопатий [11—15].

Цель настоящего исследования — изучение модулирующего эффекта димебона на FUS-протеинопатию и его влияния на дебют симптоматической стадии у FUS^1—513 мышей и ее переход в терминальную стадию.

Работы с животными проводили на базе вивария Института биологии гена РАН под контролем Комиссии по биоэтике этого института.

Эксперименты проводили на самцах линии мышей FUS^1—513 с эктопной нейроспецифической экспрессией укороченного гена FUS человека [5, 6] на генетическом фоне CD1. Линия стабильно поддерживалась в гемизиготном состоянии при скрещивании в каждом поколении с производителями линии генетического фона, что в общем случае не влияет на менделевское наследование трансгена [16].

Детекцию трансгенной кассеты проводили методом ПЦР с праймерами 5′-TCTTTGTGCAAGGCCTGGGT-3′ и 3′-AGAAGCAAGACCTCTGCAGAG-5′ по программе: 2 мин при 94 °C и далее 35 циклов (94 °C — 15 с, 58 °C — 20 с, 72 °C — 30 с). Анализировали фрагмент размером 255 п.о. в 1% агарозном геле. После проведения генотипирования группы животных содержали с постоянным доступом к воде и корму, температуре 22 °C и световом цикле 12:12 ч.

Экспериментальная группа животных (n=28) получала водный раствор димебона (70 мкг/мл) с питьевой водой начиная с 35-го дня после рождения ad libitum. Средняя расчетная доза препарата составила 15 мг/кг, что в 20 раз больше рекомендованной дозы при терапии аллергических состояний у человека. Контрольную группу мышей (n=25) содержали в обычных условиях со свободным доступом к воде. Осмотр животных проводили ежедневно для регистрации массы тела и оценки симптомов нейродегенерации. На 12-й день симптоматической стадии выживших, но находящихся на терминальной стадии заболевания мышей подвергали медикаментозной эвтаназии из соображений биоэтики.

Статистический анализ материала проводили с использованием программного обеспечения Statistica 12 («StatSoft», США). При сравнении экспериментальной и контрольной групп применяли критерий t Стьюдента. Статистически достоверными считали результаты при р≤0,05.

При прогрессировании симптоматической стадии FUS-протеинопатии в нервной системе мышей с возрастом накапливаются FUS-реактивные включения, и после 90-го дня жизни развивается нейродегенеративный процесс с преимущественным поражением двигательных нейронов и клинической картиной БАС. Стремительно прогрессирующая симптоматическая стадия модельного заболевания к 12-му дню в большинстве случаев переходит в терминальную стадию и всегда заканчивается гибелью животных [6]. Применение димебона позволило отсрочить дебют манифестации клинических симптомов нейродегенеративного процесса (рис. 1, а). Так, средний возраст появления первых признаков перехода пресимптоматической стадии в симптоматическую у животных, получавших препарат, составил 127,6±4,6 дня, при этом в контрольной группе мышей того же генотипа дебют модельного заболевания наблюдался в возрасте 110,6±4,2 дня (различия статистически достоверны). Полученные данные согласуются с результатами исследований [11], проведенных на той же линии мышей, но поддерживаемой на гибридах первого поколения C57BL/6J и CBA.

Поскольку потеря массы у FUS^1—513 мышей прямо коррелирует с выраженностью нейродегенеративного процесса [5], в данном исследовании регистрировали также массу тела животных. На момент перехода модельного заболевания из пресимптоматической стадии в симптоматическую у животных не наблюдалось потери веса, в контрольной и экспериментальной группах масса тела оставалась одинаковой (рис. 1, б).

Выявленное пролонгирование пресимптоматической стадии и отсроченная манифестация клинических симптомов является следствием замедления нейродегенеративного процесса, вызванного FUS-протеинопатией, как это было показано для других типов протеинопатий [5, 12]. Динамика прогрессирования нейродегенеративного процесса на симптоматической стадии не отличалась у животных, получавших димебон (рис. 2, а). За короткий период симптоматической стадии модельного заболевания к моменту перехода его в терминальную животные теряли до 30% массы тела в обеих группах. Динамика потери веса в них была сходной. Полученные данные говорят о том, что димебон не обладает свойством модулировать патологический процесс на симптоматической стадии.

Анализ числа животных, павших после появления выраженных клинических признаков заболевания (параличи конечностей), показал, что димебон не изменяет продолжительность периода между дебютом и терминальной стадией FUS-протеинопатии (рис. 2, б).

Таким образом, в проведенном исследовании было установлено, что применение димебона пролонгирует пресимптоматическую стадию FUS-протеинопатии, позволяя отсрочить дебют клинической симптоматики модельного заболевания у FUS^1—513 мышей. При этом димебон не влиет на симптоматические этапы FUS-протеинопатии: он не изменяет динамику заболевания и его переход в терминальную стадию. Полученные результаты дают основание рассматривать отечественный препарат димебон в качестве возможного компонента для разработки комплексной патогенетической терапии БАС, особенно при семейной форме заболевания.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (соглашение № 14.604.21.0144, идентификатор RFMEFI60414X0144).