Одной из причин развития психических нарушений является хронический или тяжелый стресс, приводящий к изменению пластических свойств нейронов и нервных сетей [1]. На уровне организма он запускает сигнальные каскады, один из которых — повышение уровня стероидных гормонов в крови. У грызунов одним из основных стероидных гормонов стресса является кортикостерон. Связывание кортикостерона с высокоаффинными минерал- и низкоаффинными глюкокортикоидными рецепторами запускает механизмы, регулирующие экспрессию различных генов. Кортикостерон либо его синтетические аналоги могут оказывать не только медленно развивающиеся эффекты, обусловленные изменениями в экспрессии генов, но и быстрые, возникающие в течение нескольких минут после применения агентов и не обусловленные влиянием на транскрипцию [2].

Одна из основных структур в мозге, имеющих высокую плотность как глюко-, так и минералокортикоидных рецепторов, — гиппокамп [2]. Было показано [3], что кортикостерон может приводить к изменению пластических свойств как возбуждающих, так и тормозных синапсов гиппокампа.

Существует предположение [4], что генерация ритмической нейрональной активности в гиппокампе обусловлена активностью различных перисоматических ГАМКергических интернейронов. Это подтверждается данными, согласно которым возникновение потенциалов действия в некоторых интернейронах четко коррелирует с развитием определенных фаз ритмической активности нейрональной сети, и модулирование активности этих интернейронов изменяет характер ритмической активности. В рамках этого предположения влияние различных агентов на сетевую активность гиппокампа в значительной степени определяется их влиянием на определенный тип интернейронов. Основными типами гиппокампальных перисоматических интернейронов, участвующих в генерации разных типов ритмической активности, являются парвальбумин- и холицистокинин-экспрессирующие (ССК) интернейроны. ССК-положительные интернейроны также экспрессируют каннабиноидные СВ1-рецепторы, и сформированные этими интернейронами на пирамидных нейронах зоны СА1 гиппокампа синапсы характеризуются асинхронным выделением медиатора [4]. Кортикостерон может модулировать различные характеристики этих синапсов [5—7]. В нашей предыдущей работе [8] показано, что применение кортикостерона приводит к увеличению амплитуды вызванных тормозных постсинаптических токов в тормозных гиппокампальных синапсах зоны СА1, характеризующихся асинхронным выделением медиатора. Оно происходило в течение первых 5 мин после применения кортикостерона, следовательно, эффект не был связан с влиянием кортикостерона на экспрессию различных белков.

В настоящее время известно [6], что активация глюкокортикоидных рецепторов может приводить к увеличению амплитуды и частоты спонтанных тормозных постсинаптических токов (сТПСТ) в зоне СА1 дорсального гиппокампа, но этот эффект, видимо, зависит от некоторых дополнительных факторов, так как не наблюдался в других исследованиях [9]. Быстро развивающийся эффект кортикостерона в дорсальном гиппокампе был обусловлен модуляцией активности СВ1-экспрессирующих тормозных синапсов [6].

Кортикостерон может оказывать различное влияние на характеристики сТПСТ в дорсальном и вентральном гиппокампе [9]. Как было указано ранее, основные исследования эффектов кортикостерона проводились в дорсальном гиппокампе, а роль различных типов синапсов в вентральном гиппокампе осталась неясной.

Цель исследования — изучить влияние кортикостерона (100 нМ) на сТПСТ в пирамидных нейронах зоны СА1 гиппокампа, а также выяснить роль тормозных синапсов, экспрессирующих каннабиоидные рецепторы, в изменениях, вызываемых кортикостероном.

Крысы линии Вистар содержались в виварии при естественном освещении и свободном доступе к воде и корму. В экспериментах использовали крысят в возрасте 18—33 дня. Крысят декапитировали, мозг извлекали и помещали в ледяной раствор для нарезки срезов, который состоял из глюконата калия 140 мМ, глюконата натрия 15 мМ, HEPES 10 мМ, NaCl 4 мМ, EGTA 0,2 мМ, рН 7,2. Горизонтальные срезы толщиной 350 мкм приготовляли на вибротоме EMS 5000. После нарезки срезы помещали в инкубационную камеру, заполненную подогретой до 35—37 °С искусственной цереброспинальной жидкостью (ИЦСЖ), содержащей NaCl 125 мМ, NaHCO₃ 25 мМ, глюкозы 25 мМ, KCl 2,5 мМ, NaH₂PO₄ 1,25 мМ, CaCl₂ 2 мМ, MgCl₂ 1 мМ. ИЦСЖ постоянно барботировалась карбогеном (95% О₂+5% СО₂). Данный метод позволяет получить срезы вентрального гиппокампа.

После нарезки срезы инкубировали в течение 30 мин. Затем один из них переносили в экспериментальную камеру на платформе микроскопа Slicescope, где постоянно перфузировали ИЦСЖ при комнатной температуре. Единичные пирамидные нейроны в зоне СА1 находили с помощью дифференциально-интерференционного контраста. Ответы от нейронов записывали с помощью патч-пипеток, заполненных (в мМ) 145 K-глюконат, 30 KCl, 10 HEPES, 4 MgATP, 10 Na-фосфокреатин, 0,3 NaGTP, pH 7,2. Сопротивление патч-пипеток было равно 4—7 МОм. Сигналы записывали с помощью усилителя Multiclamp 700 B и оцифровывали с помощью Digidata 1440 («Axon Instruments»). В экспериментах отслеживали последовательное сопротивление. Данные, полученные от клеток, в которых изменения последовательного сопротивления составляли >20%, исключали из анализа. Для записи сТПСТ срез перфузировали ИЦСЖ, содержащей 10 мкМ CNQX; потенциал клеток — 70 мВ.

Эффект кортикостерона и кортикостерона с СР-47497 исследовали в двух сериях опытов: в первой — изучали быстроразвивающийся эффект кортикостерона в течение 20 мин после начала применения (n=23 в контроле и n=6 в присутствии СР-47497); во второй — отсроченные (через 40 мин) эффекты кортикостерона (n=9 в контроле и n=9 в присутствии СР-47497). Данные, полученные в первые 20 мин во второй серии опытов, были включены в анализ данных первой серии (всего n=32 в контроле и n=15 в присутствии СР-47497).

Данные анализировали с использованием программ Clampfit, Minianalysis, Microsoft Excel. Нормальность распределений определяли по критерию Шапиро—Уилка. Для сравнения значений параметров, имеющих ненормальное распределение, использовали критерий Уилкоксона для связных выборок либо критерий Манна—Уитни. Для сравнения параметров с нормальным распределением применяли парный t-тест Стьюдента. Данные представлены в виде среднего и стандартной ошибки среднего либо медианы и размаха квартилей.

Была проведена патч-кламп-регистрация спонтанной тормозной активности в пирамидных нейронах зоны СА1 в вентральных срезах гиппокампа. Нейроны выбирали на основе их морфологии, расположения, а также того факта, что апикальный дендрит нейрона был направлен в радиальный слой (stratum radiatum). Кроме того, принадлежность регистрируемых клеток к пирамидным нейронам подтверждалась тем, что в ответ на ступеньки деполяризации нейроны отвечали характерным залпом потенциалов действия, который записывали в режиме фиксации тока, как было описано ранее [8].

Применение кортикостерона (100 нМ) приводило как к быстроразвивающимся, так и отсроченным изменениям параметров сТПСТ. Единственным быстроразвивающимся эффектом было достоверное увеличение частоты возникновения сТПСТ, которое происходило в первые 10 мин после добавления кортикостерона (рис. 1, а), сопровождаясь изменениями других параметров сТПСТ, включая характерное время нарастания и спада (рис. 1, в, г). Данное увеличение оказалось кратковременным, так как уже на 20-й минуте применения кортикостерона частота сТПСТ достоверно не отличалась от первоначальных значений. Кроме того, к 20-й минуте применения кортикостерона происходило значительное снижение амплитуды сТПСТ (pис. 1, б).

Было исследовано отсроченное влияние кортикостерона на параметры сТПСТ в ряде нейронов (n=9). Через 40 мин после добавления кортикостерона амплитуда сТПСТ статистически значимо уменьшалась. Это падение не сопровождалось изменениями частоты и характерного времени спада сТПСТ (рис. 2). Видимо, оно начинало развиваться примерно на 20-й минуте (pис. 1, б) и оставалось на низком уровне до 40-й минуты воздействия кортикостерона (pис. 2, в). Также было обнаружено небольшое увеличение времени нарастания сТПСТ (pис. 2, д).

Согласно ряду исследований [6, 7, 10], кортикостерон может оказывать влияние на параметры ГАМКергической нейротрансмиссии за счет модулирования межклеточной сигнализации, опосредованной эндоканнабиноидной системой. Для определения вклада экспрессирующих эндоканнабиноидные СВ1-рецепторы синапсов в развитие эффектов кортикостерона добавляли активатор СВ1-рецепторов СР-47497 (1 мкМ). Данная активация приводит к блокаде выброса ГАМК из этих синапсов и не влияет на ее выброс из остальных [4]. Добавление СР-47497 не приводило к значимым изменениям характеристик сТПСТ (см. таблицу).

При добавлении кортикостерона (100 нМ) на фоне СР-47497 в течение первых 10 мин его воздействия не наблюдалось увеличения частоты сТПСТ, обнаруженного в контроле. Единственным отличием было наличие малого, но статистически значимого увеличения характерного времени нарастания сТПСТ (рис. 3) через 20 мин после совместного действия кортикостерона и агониста СВ1-рецепторов. Стабильный уровень частоты и амплитуды сТПСТ сохранялся вплоть до окончания эксперимента (рис. 4). Применение кортикостерона в присутствии СР-47497 также не влияло ни на один из оставшихся параметров сТПСТ. Средняя амплитуда ответов и характерное время спада сТПСТ также значительно не менялись вплоть до 40-й минуты действия кортикостерона (см. рис. 4). Несмотря на увеличение характерного времени нарастания сТПСТ спустя 20 мин после действия кортикостерона (см. рис. 3, в), через 40 мин оно оказалось недостоверным (см. рис. 4, г).

Применение кортикостерона в первые 10 мин приводило к кратковременному увеличению частоты сТПСТ. Примерно через 20 мин после развития подъема она возвращалась к базовому уровню. Подобное быстро развивающееся увеличение частоты сТПСТ было описано в дорсальном гиппокампе [6], однако не наблюдалось в более ранней работе [9]. Быстрота развития эффекта кортикостерона говорит о том, что он возникает, скорее всего, из-за активации каскадов, не связанных с изменениями экспрессии генов. Согласно исследованию W. Hu и соавт. [6], кратковременное увеличение спонтанной тормозной активности в срезах гиппокампа, возникающее при применении кортикостерона, связано с последовательной активацией двух типов интернейронов: парвальбумин- и СВ1-экспрессирующих. СВ1-экспрессирующие интернейроны также экспрессируют ССК и могут выделять его во внеклеточное пространство [4]. Мы блокировали выброс ГАМК из ССК/СВ1-экспрессирующих нейронов за счет активации СВ1-рецепторов. Согласно исследованию [6], быстрый эффект кортикостерона обусловлен увеличением выброса ГАМК из парвальбумин-экспрессирующих интернейронов, и устранение активности других ГАМКергических синапсов не должно влиять на него. Однако W. Hu и соавт. показали, что кортикостерон приводит к синтезу оксида азота (NO) в пирамидных нейронах, диффузии NO в ССК-содержащие ГАМКергические терминали, где NO индуцирует выброс ССК. ССК в свою очередь, действуя на ГАМКергические терминали парвальбуминположительных интернейронов гиппокампа, усиливает выброс ими ГАМК и, как следствие, частоту сТПСТ. Мы блокировали активность ССК/СВ1-экспрессирующих синапсов, что должно было приводить к снижению выброса не только ГАМК, но и ССК и, следовательно, блокаде эффекта кортикостерона. Видимо, описанный [6] быстро развивающийся эффект кортикостерона не является уникальным для дорсального гиппокампа и может развиваться также в вентральном, как было показано нами, хотя его величина значительно ниже (~20%), чем в дорсальном (~50%).

Согласно полученным данным, кортикостерон оказывает не только слабый быстроразвивающийся, но и сильный отсроченный эффект, который возникает через 30—40 мин после начала его применения. Отсроченный эффект был описан ранее [9], однако в вентральном гиппокампе кортикостерон вызывал только уменьшение частоты сТПСТ, но не оказывал влияния на другие параметры. Напротив, в наших экспериментах кортикостерон не менял частоту сТПСТ, но приводил к уменьшению амплитуды и росту характерного времени нарастания. Разница между нашими данными о быстрых и отсроченных эффектах кортикостерона и данными упомянутых авторов может возникать за счет того, что в работе [9] эксперименты ставились на более молодых животных. Возможно, при взрослении происходят изменения в сигнальных путях, опосредующих действие кортикостерона; они могут также объяснить отсутствие быстрого эффекта кортикостерона у молодых животных [9] и его наличие у более взрослых особей в наших экспериментах, а также в работе [6].

Согласно нашим данным, развитие отсроченного, так же как и быстроразвивающегося эффекта кортикостерона связано с активностью СВ1/ССК-экспрессирующих интернейронов. Подавление выброса ГАМК из терминалей этих нейронов до применения кортикостерона практически не влияет на базовую частоту и амплитуду сТПСТ, но устраняет его «быстрый», а также отсроченный эффект. Механизм развития отсроченного эффекта не ясен, но на основании существующих данных можно выдвинуть следующее предположение. Учитывая промежуток времени, необходимый для развития эффекта (>30 мин), вероятно, кортикостерон индуцирует изменения в экспрессии определенных белков. Было показано [11], что кортикостерон может существенно снижать активность MAG-липазы — фермента, ответственного за деградацию одного из эндоканнабиноидов (2-арахидоноилглицерол), причем этот эффект развивается в течение десятков минут. Поскольку активация глюкокортикоидных рецепторов приводит к повышению уровня эндоканнабиноидов, в том числе 2-арахидоноилглицерола, в различных частях головного мозга (паравентрикулярное ядро [12], гипоталамус и базолатеральная амигдала[13], префронтальная кора [14]), снижение активности MAG-липазы будет приводить к его дополнительному повышению. Это в свою очередь приведет к усиленной активации СВ1-рецепторов на синаптических терминалях ССК/СВ1-положительных нейронов и, как следствие, подавлению выброса ГАМК этими интернейронами. Возможно, отсроченное снижение амплитуды сТПСТ является лишь следствием накопления эндоканнабиноидов из-за снижения активности опосредующего их деградацию фермента. Однако проверка данного предположения требует проведения дополнительных экспериментов.

Таким образом, активация глюкокортикоидных рецепторов в вентральном гиппокампе приводит к быстрому увеличению амплитуды сТПСТ, которое через 40 мин сменяется сильным снижением. Развитие обоих эффектов блокировалось активацией СВ1-рецепторов, следовательно, как быстрый, так и медленный эффекты активации глюкокортикоидных рецепторов, скорее всего, развиваются в СВ1-экспрессирующих тормозных синапсах гиппокампа.

Работа поддержана грантом РНФ 14−25−00136 (эффекты кортикостерона) и Министерством образования и науки РФ (приказ Министерства № 743 от 01.07.10, приложение, пункт 4.4, период финансирования 2010—2019) и Министерством здравоохранения РФ (2015—2017). Дополнительное государственное задание № 2 00 030 056 «Разработка инновационного подхода к диагностике и лечению нарушений сердечного ритма» (эффекты каннабиноидов).