На очередном 20-м Рабочем совещании Европейской исследовательской группы по лизосомным болезням (ЕИГЛБ) были обобщены достижения в изучении лизосомных болезней накопления (ЛБН). Совещание, на которое было приглашено 150 участников, проходило в Институте генетики и медицины Телетон (Telethon Institute of Genetics and Medicine, TIGEM).

Совещанию предшествовал курс лекций по лизосомам и лизосомным болезням (30 сентября — 1 октября). Среди них можно отметить лекции E. Lloyd-Evans «Молекулярные основы патогенеза ЛНБ», К. Settembre «Аутофагия», Т. Cox «Деградация липидов и ЛБН», G. Parenti «Деградация гликозаминогликанов и мукополисахаридозы», H. Aerts «Болезнь Гоше», B. Bigger «Терапия ЛБН».

Работа совещания открылась приветственными словами руководства ЕИГЛБ и TIGEM и докладом бывшего президента ЕИГЛБ проф. K. von Figura (Германия), который представил историю изучения лизосомных болезней и выделил основные направления новых терапевтических подходов. Среди них обратил внимание на возможность исправления генетического дефекта сульфатазной недостаточности. Этот дефект может исправляться заменой сульфгидрильной группы модифицированного глицина в арилсульфатазе, А на Сα-формильную группу с дальнейшим использованием соответствующего гена для клонирования и получения рекомбинантных сульфатаз терапевтического назначения.

Дополнительно к упоминавшимся выше лекциям в основной программе совещания были представлены еще четыре лекции по актуальным проблемам лизосомологии. Так, A. Galione (Англия) посвятил свою лекцию кальциевым каналам и эндолизисомной сигнализации кальция, T. Cox (Англия) прочитал лекцию «Болезнь Гоше», в которой были рассмотрены комплексное поражение систем организма при этом заболевании и основные терапевтические приемы: обновление популяции макрофагов (трансплантация гемопоэтических и стволовых клеток), субстратная депривация (подавление синтеза сфинголипидов), генная терапия и т. д. Внимание участников совещания привлек пример успешного использования заместительной энзимотерапии цередазой — β-глюкоцереброзидазой, за 20 лет энзимотерапии был практически вылечен пациент, живущий в настоящее время полноценной жизнью и ставший отцом трех детей. D. Rubinstein (Англия) обсудил некоторые пути влияния аутофагии на процессы нейродегенерации. Было показано, что аутофагия способна повышать устойчивость клеток к апоптозу, конкурируя за мессенджеры клеточного выживания и подавляя проапоптозную сигнализацию. Отмечено, что разрабатывается новая стратегия стимуляции неканонических путей аутофагии (в частности, посредством PI (5)P) в дополнение к классической регуляции аутофагии, используемой для повышения выживаемости клеток. M. Jaattela (Дания) представила свою концепцию влияния лизосом на выживаемость клеток и возможности новых терапевтических воздействий. Она показала, что мутации различных лизосомных белков вызывают в целом снижение стабильности лизосомных мембран. Освобождение лизосомных катепсинов В и D может приводить к атаке митохондрий пептидами Bax и Bak, вызывающими пермеабилизацию мембран митохондрий и освобождение цитохрома с, запускающего апоптогенный каскад активации каспаз. Важно следить за проницаемостью мембран лизосом путем использования новых прижизненных маркеров, таких как лектин галактин, связывающийся с лизосомной β-галактозидазой и видимый благодаря внедрению в клетки генетической конструкции mCherry-Gal3 (экспрессия коньюгата окрашенного белка mCherry с галактином). Были получены данные в пользу того, что метастазирование связано с дисфункцией лизосом, опосредуется освобождением цистеиновых катепсинов. А такие белки, как Hsp70, серпины, цистатины препятствуют высвобождению катепсинов. Hsp70 оказывает эффект посредством связывания с бис (моноацилглицеро)фосфатом (BMP) мембраны лизосом и активацией кислой сфингомиелиназы, которая, судя по приведенным данным, оказывает мембраностабилизирующее действие. В результате Hsp70 препятствует лизосомной патологии при лизосомных болезнях накопления, например при болезни Нимана—Пика улучшает моторную функцию мозга, а катионные амфифильные препараты (лоратидин, тетрафенадин и др.) ингибируют этот фермент и способствуют гибели клеток, важной для онкотерапии. Кроме того, кислая сфингомиелиназа способствует формированию аутофагосом (точнее, аутофагофоры), и ее ингибирование тормозит репаративную аутофагию и помогает гибели онкотрансформированных клеток.

Основная программа совещания была разделена на сессии, посвященные биологии лизосом, патогенезу лизосомальных болезней и их моделям на животных, а также терапии ЛБН. В отличие от предыдущих научная программа этого совещания была в большой мере посвящена фундаментальным аспектам рассматриваемой патологии. Во многом это было связано с фундаментальными исследованиями лизосомной патологии, проводимыми в TIGEM под руководством проф. A. Ballabio.

Перед тем как перейти к изложению отдельных докладов, отметим, что в последнее время лизосомные ферменты рассматриваются как потенциальные маркеры таких заболеваний, как болезнь Альцгеймера (БА), болезнь Паркинсона (БП) и деменция с тельцами Леви. Повышенный уровень лизосомных протеаз катепсинов B и D выявлен в цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) и мозге пациентов с Б.А. Аналогично повышена активность лизосомных β-галактозидазы и катепсина Е в ЦСЖ при Б.П. Однако в других исследованиях найдено снижение активности β-глюкоцереброзидазы в ЦСЖ пациентов с БП и деменцией и рост активности β-гексозаминидазы при Б.П. Эти отличия активности ферментов при БА, БП и деменции с тельцами Леви в сравнении с контролем могут быть результатом регуляторного изменения лизосом мозга. Однако взаимосвязь этих показателей в ЦСЖ и мозговой ткани пока не установлена, поскольку происхождение лизосомных ферментов ЦСЖ неизвестно. Главная гипотеза состоит в том, что лизосомные ферменты могут попадать в ЦСЖ из головного мозга в ходе секреторно опосредованного переноса ферментов из аппарата Гольджи в лизосомы. Однако возможно их проникновение и из других тканей благодаря проницаемости для ферментов гематоэнцефалического барьера. Лизосомная кислая α-маннозидаза распространена повсеместно в организме человека в двух формах — А и В. В крови преобладает ее промежуточная форма с оптимумом рН 5,5. Профиль изоформ фермента в ЦСЖ сходен с таковым в области лобной коры головного мозга (наличие изоформ, А и В), но отличается от профиля плазмы крови; в ЦСЖ не найдено промежуточной формы фермента. Таким образом, α-маннозидаза ЦСЖ имеет происхождение из мозга и может отражать некоторые особенности его нейроморфологии при БП (эти данные фигурировали в постере A. Tasegian, Италия).

В докладе R. Bartolomeo (Италия) сообщалось, что синдром лизосомного накопления подавляет такие важнейшие клеточные функции, как эндоцитоз и аутофагия. А аутофагия в свою очередь является механизмом поддержания клеточного гомеостаза, регулируемым посредством сенсоров комплекса mTORC1. Авторы установили, что этот комплекс вовлечен в формирование мукополисахаридоза MPSVII при использовании модели заболевания на животных. Выделенные из тканей таких мышей хондроциты обнаружили низкую чувствительность mTORC1 к недостаточности питательного обеспечения, зависимую от белка Raptor этого комплекса. Выявленный эффект влиял на рост костей. Генетическая или фармакологическая коррекция сигнализации mTORC1 восстанавливала активность аутофагии в хондроцитах и позитивно влияла на формирование костей.

Связь нейродегенерации с аутофагией прослежена в экспериментах по осмотическому тестированию последней, являющемуся функциональным тестом на ее активность (содержание аутофаголизосом), была представлена в сообщении А.Б. Пупышева (Россия). Тест показал достаточную чувствительность при индукции аутофагии в печени голоданием (1 и 2 сут), оценке липидоза печени, вызванного полоксамером Р-407, и, наконец, при лечении преждевременного старения крыс линии OXYS цефтриаксоном. Препарат вызывал рост осмотического теста в передней коре мозга крыс OXYS, что соответствует индукции протективной аутофагии.

L. Brandenstain (Германия) показал возможность моделирования цероидного липофусциноза нейронов (NCL) нокаутированием гена Cln7/Mfsd8, кодирующего белок лизосомной мембраны Cln7. В экспериментах докладчика это дало жизнеспособных фертильных мышей с признаками нейродегенерации. При преждевременной гибели животных в различных отделах головного мозга было обнаружено торможение аутофагового потока, по-видимому, обусловливающего развитие нейроморфологической патологии.

В экспериментах J. Cooper (Англия) NCL моделировали в потомстве мышей с генотипом Ppt1 (-/-) (дефект гена Cln1). Было найдено, что патология спинного мозга развивается раньше поражения головного мозга. Поэтому терапевтической мишенью был избран спинной мозг, ставший объектом заместительной энзимотерапии ферментом пальмитоил-белок-тиоэстераза-1 (PPT1). Лечение ферментом путем введения в ЦСЖ дало ослабление выраженности патологии спинного мозга, включая снижение синаптической недостаточности.

Доклад N. Mitchell (Новая Зеландия) был посвящен модели NCL (CLN5 и CLN6) на овцах. В этом случае были воспроизведены нейродегенерация и лизосомное накопление, свойственное лизосомным болезням. Изучали возможности лечения с помощью направляемой в ЦНС векторной (аденоассоциированная) генотерапии (AAV). Овцам с генотипом CLN5 (-/-) вводили генетическую конструкция AAV9-CLN5 внутрь коры и желудочка мозга, и через 18 мес нашли коррекцию их фенотипа, нормализацию внутричерепного объема, улучшение когнитивных функций мозга и нейрофизиологии. Введение конструкций в желудочки мозга давало распространение агента по всей ЦНС, оказывало лучший эффект, чем инъекции в кору мозга. Аналогичный терапевтический эффект получен для овец CLN6 (-/-) (модель болезни Баттена) и конструкции AAV9-CLN6.

Связь ЛБН с другими заболеваниями на примере болезни Гоше (дефект β-глюкоцереброзидазы, кодируемой геном GBA) и БП была представлена в докладе M. Horowitz (Израиль). Обе болезни взаимно повышают риск возникновения друг друга. При болезни Гоше экспрессия мутантной глюкоцереброзидазы сопровождается стрессом эндоплазматического ретикулума, ведущим к клеточной реакции на нерасплетенные белки (Unfolded Protein Response, UPR). А эти изменения в свою очередь характерны для формирования Б.П. На модели болезни Гоше (D. melanogaster, GBA (-/-)) нашли сокращение срока жизни, поражение дофаминовых нейронов и поведенческих реакций, накопление α-синуклеина, свойственные БП, хотя на гетерозиготы эти изменения не распространялись. Коррекция патологии с помощью фармакологического шаперона амброксола, снижающего накопление мутантной β-глюкоцереброзидазы в эндоплазматическом ретикулулиме, исправляла дефект роста мутанта 83GG. Таким образом, при болезни Гоше накопление мутантного фермента с дефектом конформации ведет к индукции стресса в системе эндоплазматического ретикулума, гибели дофаминовых нейронов, формированию признаков БП.

Известно, что пациенты с болезнью Гоше имеют 5-кратный риск развития БП по сравнению со здоровыми. M. Ceccarini (Италия) были приведены данные, показывающие, что глюкозилцерамид, накапливающийся при болезни Гоше, обладает стабилизирующим действием на растворимые формы α-синуклеина. Следствием этого является недостаточность β-глюкозилцереброзидазы, которая может способствовать агрегации и накоплению α-синуклеина. У пациентов с БП по сравнению с контролем нашли снижение активности фермента в ЦСЖ (особенно на ранней стадии) вместе с повышением содержания олигомерного α-синуклеина. Эти два параметра плюс повышенный уровень β-гексозаминидазы позволяют отличить пациентов с БП от неврологических. По сравнению со здоровыми активность β-глюкозилцереброзидазы в ЦСЖ была немного ниже, а катепсина Е — существенно выше. Для изолированных фибробластов при БП (независимо от болезни Гоше) обнаружена высокая активность β-гексозаминидазы и низкая активность β-глюкозилцере-брозидазы, которая распространялась и на мозг. В целом показано, что анализ лизосомных ферментов в ЦСЖ дает надежные и воспроизводимые диагностические результаты.

Доклад M. Damme (Германия) был посвящен Б.А. Докладчик обратил внимание на то, что ранние изменения лизосом иногда предшествуют накоплению токсичного β-амилоида (APP). Среди генов предрасположенности к болезни выявлен ген, кодирущий фермент лизосом фосфолипазу D (Pld3) с высокой активностью в мозге. Для генома Pld3 (-/-) найдена мягкая форма заболевания, включая нарушение поведенческих реакций, но без влияния на уровень APP in vivo, а повышенная экспрессия фермента в культуре клеток ведет к существенному снижению патогенного APP и экспрессии лизосомных ферментов.

Наиболее важным направлением в лечении ЛБН являются попытки торможения процесса нейродегенерации. Один из таких подходов — введение рекомбинантного белка теплового шока Hsp70, являющегося одновременно шапероном. Соответствующие материалы были приведены T. Kirkegaard и C. Fog-Tonnesen (Дания), которые нашли, что это способствует связыванию ферментов деградации сфинголипидов с их кофактором BMP in vitro и ослабляет патологию лизосом первичных культур дефектных фибробластов от 14 пациентов с девятью ЛБН. Hsp70 эффективно проникал в различные органы мыши, включая ЦНС, ингибируя накопление гликосфинголипидов на мышиных моделях болезней Фабри, Зандхофа, NPC и эффективно уменьшая выраженность неврологических симптомов у двух последних моделей. Дополнительное применение аримокломола, являющегося клиническим препаратом, низкомолекулярным ко-индуктором Hsp70, усиливает действие Hsp70 в устранении нейропатологии и симптомов ЛБН. Таким образом, полученные результаты по применению Hsp70 обнадеживают в поиске путей терапии ЛБН.

В докладе J. Klumperman (Голландия) речь шла о роли белка лизосом Vps41, участвующего в слиянии кислых везикул, в транспорте белка лизосом LIMP2, являющегося рецептором GBA, дефицит которой приводит к болезни Гоше. Этот белок регулирует транспорт белков LAMP-1 и 2, NPC-1, LIMP-2/GBA из аппарата Гольджи в лизосомы, но в то же время способствует слиянию эндосом с лизосомами. Полагают, Vps41 нужен для поддержания стабильности лизосом и липидного гомеостаза. В конечном счете он считается протективным фактором в предотвращении нейродегенерации.

Материалы, представленные Т.А. Короленко (Россия) отразили модель индукции липидоза, вызываемого ингибированием липаз полоксамером Р-407. Было установлено резкое повышение уровня атерогенных липидов крови, превышающее таковое при семейной гиперхолестеринемии. Липидоз был выражен в макрофагах печени и сопровождался ростом активности хитотриозидазы, т. е. имел признаки лизосомной перегрузки, способной вызвать вторичные клеточные изменения.

Совещание также показало, что в формировании ЛБН заметная роль отводится транскрипционному фактору EB (TFEB), регулирующему экспрессию лизосомных гидролаз, везикулярный транспорт и аутофагию (доклад S. Raimo, Италия). Его гиперэкспрессия у мышей приводит к подавлению симптомов ЛБН. Однако при исследовании ряда ЛБН (MPSIIIA, MSD, болезнь Зандхофа) нашли повышенную транскрипцию фактора в нейронах и микроглии, и его ядерную транслокацию, соответствующую активации фактора. В дальнейшем на модели болезни Гоше, вызываемой кондуритол-В-эпоксидом (ингибитор β-глюкоцереброзидазы), нашли ядерную транслокацию TFEB в клетках HeLa. Как и для других ЛБН, повышенная экспрессия TFEB вела к снижению лизосомного накопления (судя по уровню глюкоцереброзидов). А у мышей с дефицитом фактора наблюдали накопление липидов в клетках печени и рост накопительного (лизосомный) компартмента. Таким образом, возникло предположение, что в ходе формирования ЛБН TFEB играет протективную роль, связанную с клеточным очищением от накапливаемого материала.

При изучении ЛБН на анимальных моделях и культурах нейронов (в частности, при MSPIIIA) была отмечена прогрессирующая потеря растворимого α-синуклеина и белка CSPα, что в свою очередь негативно влияет на уровень белка SNARE слияния везикул в пресинаптических окончаниях. В докладе I. Sambri (Италия) в этих условиях было найдено накопление нерастворимого α-синуклеина, а растворимый α-синуклеин, наоборот, помогал рециклированию синаптических везикул. Гиперэкспрессия CSPα в мозге дефектных мышей восстанавливала уровень SNARE и способствовала функции синапсов и подавлению нейродегенерации. Таким образом, при ЛБН нарушается функционирование пресинаптических везикул, зависимое от гомеостаза SNARE в нервных окончаниях.

В материалах постера G. DiFruscio (Италия) на основе представлений, что аутофагия универсально вовлечена в формирование ЛБН и нейродегенерацию, было предложено контролировать мутации аутофаго-лизосомного пути с помощью лизоплекса (lysoplex) — адресного секвенирования препаратом нового поколения. Этот подход позволяет различать цепочки 891 гена, вовлеченного в функционирование лизосом, эндоцитоз и аутофагию. Лизоплекс опробован на 14 ЛБН и затем пациентах с клиническим фенотипом NCL с неизвестными мутациями. Были идентифицированы патогенные мутации у 67% пациентов, большинство которых не поддавалось выявлению обычными технологиями секвенирования (например, общепринятым полным экзомным секвенированием — WES). В среднем было идентифицировано на 50% больше подтвержденных изменений аминокислотного состава и укорочения пептидов в расчете на один ген. В целом идентифицировали 61 укорочение последовательностей и 488 миссенс-мутаций с высокой вероятностью потери функции 316 генов. Таким образом, лизоплекс дает современный каталог кодовых вариаций генов кислого везикулярного аппарата и позволяет соотнести их с клеточными изменениями, связанными с ЛБН.

В другом исследовании — M. Blomqvist (Швеция) с использованием аналогичного подхода обследовали 20 пациентов с лизосомными или пероксисомными болезнями. Ранее с помощью секвенирования Сэнджера нашли патогенные мутации у всех этих пациентов. Обычный набор мишеней включал 60 экзонов и фланк-области 90 генов. Создание библиотеки было выполнено с помощью платформы SureSelectQXT (Agilent). В результате ожидаемые патогенные мутации были найдены у всех 20 пациентов. В коммерческой базе, охватывающей 281 вариант, примененная панель показала чувствительность 100% и специфичность 97%. В целом получен полезный инструмент для выявления патогенных мутаций ЛБН облегченным методом.

Преклиническая подготовка генной терапии мукополисахаридоза MPSIIIA была осуществлена S. Ellison (Англия). Указанное заболевание связано с дефектом N-сульфоглюкозамин-сульфогидролазы, лизосомным накоплением гепаринсульфата, которые поражают прежде всего головной мозг. Заместительная энзимотерапия нормальным ферментом неэффективна в силу непроницаемости гематоэнцефалического барьера. Проблему может решить трансплантация гемопоэтических стволовых клеток благодаря внедрению моноцитов в мозге и выработке ими недостающего фермента. Это подход оказался полезным в лечении мукополисахаридоза MPSI (Hurler). Однако для лечения MPSIIIA наработка недостающего фермента адресованными моноцитами оказалась недостаточной. Поэтому специально повысили продукцию фермента стволовыми клетками с помощью внедрения генной конструкции лентивирусного вектора с геном нормального фермента. В конечном счете удалось повысить содержание фермента в мозге до 11% от нормы, что исправляло поведенческие реакции, устраняло нейровоспаление, существенно повышало выживаемость мышей, нормализовало уровень гликозаминогликанов и размеры лизосом. Преклиническое испытание токсичности примененной конструкции на CD34±клетках человека показало, что при 10-, 20-кратном повышении уровня фермента относительно нормы токсичность воздействия не росла, равно как частота трансформации и другие параметры лентивирусной доставки генов, применяемой в клинике. В 2016 г. планируется проведение фаз I/II клинических испытаний конструкции в лечении MPSIIIA человека.

По данным H. Gleitz (Англия), лентивируcные конструкции оказались полезными и в разработке лечения мукополисахаридоза MPSII (дефект идуронат-2-сульфатазы, ген IDS). Этот докладчик использовал лентивирусные векторы третьего поколения с миелоид-специфичным промотором hCD11b, нацеленным на мозг, и ассоциированные с генами IDS, SUMF1 и TFEB. Было показано, что они повышают уровень соответствующих им белков in vivo, а также улучшают поведенческие реакции мышей с MPSII. Более того, получили мышей, нокаутированных по гену Ids, соответствующих высокой остроте заболевания. На них также получен позитивный неврологический эффект, отслеживаемый в динамике роста мышей (до 8 мес).

Для коррекции мышиной модели болезни Зандхофа L. Rouviere (Франция) использовал аденоассоциированную (AAV) доставку корригирующих генов. Вектор AAV9 с геном гексозаминидазы В и промотором PGK вводили внутривенно. Такое лечение повышало срок жизни животных со 120 дней до нормы (не менее 700 дней) и предотвращало основные симптомы заболевания, включая нейропатологию. Было установлено, что активность гексозаминидаз, А и В повышалась до терапевтически необходимого уровня (а для гексозаминидазы, А — до 15% от нормы для мозга и до 40% — для печени) и этот уровень сохранялся повышенным в диапазоне 2—24 мес. Лечение способствовало устранению накопления ганглиозидов в мозге (2—4 мес), в том числе в значительной мере — в мозжечке, подавлялась гибель нейронов, астроцитов и клеток микроглии. Таким образом, лечение новорожденных мышей с помощью внутривенного введения вектора AAV9-HexB дает хорошие результаты.

Подобный подход был применен и в отношении мукополисахаридоза MPSIIIC, сопровождающегося поражением ЦНС. C. O’Leary (Англия) поставил задачу доставки недостающего фермента (HSGNAT) в мозг. Для этого были использованы система ААV и интракраниальное введение препарата, потенциально способные эффективно восстановить активность фермента в мозге и скоррегировать неврологические нарушения на мышиной модели заболевания. Введение конструкции AAV-HSGNAT в стриатум повышало уровень фермента выше нормы дикого типа, особенно выраженно в зоне инъекции и ближних отделах R2 и R3 (свыше 300%).

Клиницисты считают, что заместительная энзимотерапия является слишком дорогим лечением, она эффективна при ограниченном круге ЛБН, и поэтому активно исследуются другие подходы. Найдено, что однократное введение низких доз аденоассоциированного вектора с серотипом 8 (AAV2/8) мышам с MPSVI так же эффективно, как заместительная энзимотерапия ферментом в течение 1 нед (R. Ferla, Италия). При этом введение больших доз конструкции (уже становится дорогостоящим лечением) может приводить к нежелательным иммунным реакциям, поэтому применили комбинацию низких доз генотерапии и редких сеансов заместительной энзимотерапии (ежемесячно). Совместная терапия приводила к снижению содержания гликозаминогликанов в моче, подавлению лизосомного накопления в миокарде и была так же эффективна, как высокие дозы генной терапии или обычная еженедельная заместительная энзимотерапия. Таким образом, снижение доз данных терапевтических воздействий повышает безопасность и снижает риски и стоимость лечения.

L. Ferri (Италия) предлагает проверять эффективность лечения ЛБН предварительно на изолированных клетках пациента. Так, для болезни Фабри (дефект α-галактозидазы А) получили генотрансформированные клетки, содержащие разные мутации гена фермента от 6 разных пациентов, и испытали действие химического шаперона DGJ. У всех клеток была снижена активность α-галактозидазы, а позитивный эффект терапии обнаружен только для двух вариантов клеток из шести. Таким образом, функциональное тестирование лечения на клеточных культурах является полезным подходом для прогноза эффективности лечения.

Интересные данные получены при изучении муколипидоза II (MLII, I-cell disease) S. Krambeck (Германия). Как известно, эта форма патологии характеризуется исчезновением из клеток многих лизосомных ферментов в результате дефекта рецептора манноза-6-фосфата (М-6-Р) и накоплением недеградируемого материала. Ключевым ферментом синтеза рецептора является глюкоза-N-ацетил-фосфотрансфераза. Несмотря на этот дефект, в гепатоцитах и клетках Купфера печени и лейкоцитах крови содержание лизосомных ферментов практически не менялось. В связи с этим исследовали замещающие пути внутриклеточного транспорта лизосомных ферментов. В гомогенате печени нашли высокую активность идуронат-2-сульфатазы, α-фукозидазы, тогда как α-L-идуронидаза и β-глюкуронидаза были без изменений. А с помощью вестерн-блоттинга и иммунофлюоресценции нашли дополнительно эффективный М-6-Р-независмый транспорт в лизосомы катепсинов B, D, Z. На изолированных гепатоцитах было показано, что достаточно хорошо достигают лизосом катепсины B, D, Z, нейраминидаза I. Страдал транспорт холестеринсвязывающего белка Npc2, однако это не приводило к накоплению неэтерифицированного холестерина в лизосомах. Эндоцитоз М-6-Р-содержащей арилсульфатазы В слабо повышался. В целом в противоположность фибробластам пациентов с MLII ни экспрессия, ни распределение рецепторов М-6-Р, ни содержание лизосомных ферментов в гепатоцитах существенно не изменялись. И даже активность аутофагии, оцениваемой по маркеру LС3-II, не была снижена. Таким образом, гепатоциты снабжены активным М-6-Р-независимым механизмом транспорта лизосомных ферментов для обеспечения лизосомного и клеточного гомеостаза в печени.

Предпринимаются попытки получения удобных маркеров слежения за прогрессированием и эффективностью терапии лизосомных болезней, в частности для болезни Помпе. Об этом свидетельствует сообщение G. Parenti (Италия). Используя технологию NGS, исследовали тканеспецифичные микро-РНК, локализующиеся в сердце и мышцах или циркулирующие в крови анимальной модели заболевания. Был выявлен большой спектр тканеспецифичных микро-РНК, экспрессирующихся на разные сроки заболевания (3 и 9 мес), и 42 вида были общими на оба срока. В плазме крови больных нашли отличия у 7 пациентов с инфантильной формой болезни Фабри и 10 — с поздней. В целом предлагается клиническое использование этого диагностического подхода, отражающего тяжесть течения болезни Фабри.

Разрабатывается доставка в мозг при MPSII недостающего фермента идуронат-2-сульфатазы посредством носителей — полимерных наночастиц с прикрепленным адресованным в мозг пептидом g7. L. Rigon (Италия) на мышиной модели заболевания было установлено прохождение частицами гематоэнцефалического барьера и повышение эффективности доставки фермента, правда, нуждающейся в ускорении освобождения фермента из частиц.

Терапия ЛБН субстратной депривацией может осуществляться и с помощью мелких интерферирующих РНК (siRNА), способных подавлять экспрессию целевых генов. На примере мукополисахаридоза MPSIIIC (дефект ацетил-СоА-α-глюкозаминид-N-ацетилтрансферазы) применили siRNА генов EXTL2 и EXTL3, кодирующих синтез гепарансульфата, накапливающегося при данном заболевании, этот вопрос был рассмотрен L. Vilageliu (Испания). На фибробластах 2 пациентов четыре вида таких РНК на 90% подавляли синтез мРНК соответствующих генов и наработку гликозаминогликанов (на 30—60% через 3 дня) и их накопление (до 24% через 14 дней). А с помощью иммуноцитохимии показали признаки терапевтической нормализации фентотипа. Таким образом, данный подход перспективен в лечении синдрома Санфилиппо.

Как видно из настоящего обзора совещания, специалисты, входящие в Европейское сообщество лизосомологов, не только исследуют фундаментальные аспекты работы и патологии лизосомного аппарата, но и активно разрабатывают новые диагностические и терапевтические подходы в лечении ЛБН. Центральное место в них занимают коррекция или устранение нейроморфологических проявлений патологии, исследование аутофагии как внутреннего клеточного резерва выживания клеток и разработка средств генной терапии ЛБН.

Новым Президентом ЕИГЛБ избран B. Bigger (Великобритания). Следующее рабочее совещание ЕИГЛБ состоится в 2017 г. в Лионе (Франция).

А.Б. Пупышев (Новосибирск)