До настоящего времени причины развития болезни Паркинсона (БП) остаются неизвестными. Большое значение в этиологии БП придается генетическим факторам, особенно при манифестации заболевания в молодом возрасте [1, 2]. Среди всей совокупности генов редких наследственных форм БП ключевое место занимает ген PARK2 на 6-й хромосоме: будучи связанным в основном с аутосомно-рецессивным юношеским паркинсонизмом, он обусловливает не менее 10% всех случаев БП с дебютом до 40 лет [3—5]. Продукт данного гена, цитоплазматический белок паркин, участвует в процессинге митохондрий и рассматривается в качестве нейропротективного агента, обеспечивающего выживаемость дофаминергических нейронов при воздействии различных нейротоксинов [6, 7]. В связи с такой значимой общебиологической ролью гена PARK2 он на протяжении ряда лет находится в центре внимания исследователей, занимающихся молекулярными механизмами БП.

Основные клинические проявления БП связаны с дегенерацией дофаминергического нигростриарного пути. Течение заболевания и характер осложнений многолетней заместительной терапии препаратами леводопы в значительной степени зависят от динамики превращения леводопы в дофамин, выделения дофамина в синаптическую щель и его обратного захвата пресинаптическими терминалями [8]. Система регулирования уровня синаптического дофамина включает в себя особый белок — дофаминовый транспортер (DAT), который находится на мембране дофаминергических нейронов и, реагируя на сигнал пресинаптических D2-ауторецепторов, контролирует возвращение медиатора в терминаль [9, 10]. Поэтому изучение функциональных характеристик DAT имеет большое значение для оптимизации эффектов противопаркинсонических препаратов.

Возможности раскрытия фундаментальных механизмов нейродегенеративного процесса при БП определяются использованием адекватных моделей данного заболевания. Одной из наиболее перспективных моделей in vitro является культура дофаминергических нейронов, получаемых в результате репрограммирования фибробластов кожи в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) и их последующей направленной дифференцировки [11—13].

Цель исследования — функциональный анализ DAT при аутосомно-рецессивной Б.П. Функциональная оценка дофаминергических нейронов, полученных от пациента с PARK2-формой БП, проводилась на указанной выше модели с использованием нового метода, основанного на свойствах флуоресцентного субстрата ASP+ (4-dimethylamino-styryl-N-methylpyridiniumiodide) захватываться дофаминовым транспортером, что можно визуализировать при помощи флуоресцентной микроскопии [14, 15].

В работе были использованы культуры клеток здорового донора (Po2) и пациента с аутосомно-рецессивным ювенильным паркинсонизмом (Tr5), являющегося носителем компаунд-гетерозиготных мутаций в гене PARK2 (del202−203AG и IVS1+1G/A). Из биоптатов кожи обоих исследуемых нами ранее были получены фибробласты, которые были репрограммированы при помощи оригинальных лентивирусных векторов с факторами плюрипотентности (LeGO-hOCT4, LeGO-hSOX2-IRES-GFP, LeGO-hc-Myc, LeGO-hKLF4) с целью получения клонов ИПСК [12, 13]. Далее клетки были дифференцированы по нейрональному типу с использованием факторов дифференцировки согласно описанной технологии [13, 16].

Количественный анализ экспрессии DAT определяли методом вестерн-блоттинга по стандартной методике. Определение экспрессии DAT на поверхности дофаминергических нейронов в культуре проводили методом непрямого иммунофлюоресцентного окрашивания с детекцией на проточном цитометре AccuriCytometres (Bio-Rad), обработку результатов проводили по программе WinMDI 2.8 («Scripps Institute, LaJolla», США). Оценку экспрессии DAT проводили также на уровне мРНК с помощью обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ПЦР) согласно протоколам (PureLink RNAMiniKit, DNaseDNAseI, ThermoFisherScientific; MMLVRTkit, «Evrogen»). ПЦР в реальном времени на полученной мРНК проводилась при помощи наборов qPCRmix-HSSYBR + HighROX («Evrogen») в соответствии с указаниями к протоколу в программе StepOnePlus (Applied Biosystems). Праймеры для DAT и ActB (контроль для нормирования данных) были синтезированы в фирме «Evrogen» (Москва). Отрицательный контроль в присутствии стерильной воды был выполнен в каждом исследовании для всех праймеров. Каждая проба была проанализирована тремя параллельными исследованиями.

Определение флуоресценции дофаминового аналога ASP+ проводили методом проточной цитометрии: дофаминергические нейроны окрашивали внесением в среду ASP+ в различных концентрациях от 10^–9 до 10^–3 М, инкубация проходила в течение 10 мин в темноте при комнатной температуре. Полученные данные представляли в виде концентрационной кривой с логарифмической шкалой. Также клетки в присутствии 10^–3 М дофамина инкубировали с ASP+ в концентрации 10^–5 М для исследования конкурентного ингибирования в обеих исследуемых линиях. Параллельно конкурентное ингибирование DAT в присутствии дофамина и ASP+ оценивалось методом конфокальной микроскопии (Olympus IX81): клетки, прикрепленные к поверхности чашки Петри размером 35 мм², обработанной матригелем (Мембрана BD Matrigel, США) были нагружены дофамином в концентрации 10^–3М, через 10 мин они отмывались раствором среды инкубации и инкубировались в течение 10 мин с ASP+, результаты обрабатывались в программе Image-G.

С помощью вестерн-блоттинга был исследован уровень белка DAT в культурах дофаминергических нейронов, полученных от пациента — носителя мутаций в гене PARK2 и от здорового донора; в качестве контроля были проанализированы лизаты клеток линии HeLa, поскольку в клетках данной опухолевой линии присутствует DAT [17]. Как видно из рис. 1, содержание белка DAT в мутантной культуре нейронов было достоверно выше (на 61%) по сравнению с генетически нормальной культурой. Сходные данные были получены при анализе экспрессии DAT путем оценки уровня мРНК DAT (экспрессия DAT в «мутантных» дофаминергических нейронах была на 15% выше, чем в клетках здорового донора) и при количественном анализе DAT в клеточных культурах методом проточной цитометрии (рис. 2). Как видно на рис. 2, анализ исследуемой популяции окрашенных антителами клеток свидетельствует, что клеточная линия Po2 (контроль) содержит вчетверо меньшее количество DAT (12,36%) по сравнению с «мутантной» линией Tr5 (42,29%).

Для оценки функциональной активности DAT в исследуемых культурах дофаминергических нейронов с помощью проточной цитометрии клетки обеих популяций были нагружены флуоресцентным субстратом для DAT — ASP+. На рис. 3 видно, что характер зависимости флуоресценции от концентрации ASP+ является сходным в обеих клеточных культурах, однако кривая для клеточной линии Po2 (контроль) находится стабильно выше, чем для линии Tr5 (клетки с мутациями PARK2). Это означает, что синаптический захват исследуемого дофаминергического лиганда клетками здоровой нейрональной культуры больше по сравнению с мутантными нейронами, т. е. активность DAT в норме выше по сравнению с носительством мутаций PARK2.

Для подтверждения выявленных закономерностей нами был использован метод конкурентного ингибирования захвата ASP+ с помощью дофамина, который имеет большее сродство к DAT, чем ASP+. Как видно на рис. 3, б, накопление ASP+ приводит к увеличению сигнала флюоресценции в здоровых клетках, что достоверно выше уровня флуоресценции у клеток линии Tr5. Напротив, при добавлении в среду дофамина уровень флуоресценции (отражающий накопление ASP+) в здоровых клетках снижается по сравнению с мутантными. Это свидетельствует о преимущественном захвате здоровыми дофаминергическими нейронами естественного лиганда DAT дофамина, тогда как в мутантных нейронах в условиях конкурентного связывания активность DAT в отношении дофамина существенно ниже.

Таким образом, носительство мутаций PARK2 в культуре дофаминергических нейронов, полученных от пациента с генетической формой БП, сопровождается гиперэкспрессией DAT, что проявляется повышением уровня мРНК и белка DAT в клетках. Известно, что изменения экспрессии DAT являются важным механизмом, обеспечивающих длительную отсрочку клинических проявлений развивающегося нистростриарного дофаминергического дефицита при БП, вплоть до гибели 50—60% нигральных нейронов [18, 19]. В литературе есть данные как о снижении, так и о повышении экспрессии DAT в экспериментальных моделях паркинсонизма [19—21], что связано со сложностью регуляции обмена дофамина. Предполагается, что на ранней стадии нейродегенерации повышение экспрессии DAT может отражать попытку клетки сохранить цитозольный уровень дофамина на фоне начавшейся гибели пресинаптических DAT-структур [22]. Полученные нами in vitro данные позволяют подтвердить, что при PARK2-паркинсонизме гиперэкспрессия DAT является значимым фактором нейропластичности, обеспечивающим повышение кругооборота дофамина в синаптических нигростриарных терминалях в условиях патологии. На определенном этапе, однако, эта реакция теряет свою компенсаторную направленность и, напротив, может усугублять поражение дофаминергических нейронов: в эксперименте показано, что длительное повышение экспрессии DAT у трансгенных животных ведет к окислительному стрессу, гибели клеток и леводопа-чувствительным двигательным нарушениям [23]. Нельзя исключить, что хорошо известная склонность пациентов с аутосомно-рецессивным PARK2-паркинсонизмом к быстрому появлению выраженных леводопа-индуцированных дискинезий [24, 25] может быть связана с рассмотренными выше изменениями в системе DAT—дофамин.

Несмотря на повышенный уровень DAT в нейронах с мутантным генотипом, эти клетки характеризуются угнетением общей функциональной активности DAT, что четко зафиксировано нами в экспериментах с использованием проточной цитометрии. Следовательно, мутации в гене PARK2 нарушают эффективность обратного захвата дофамина в дофаминергическом синапсе. Этот фактор снижает компенсаторные возможности нигростриарной системы и может способствовать раннему дебюту заболевания. Действительно, носительство мутаций PARK2 обычно проявляется юношеским паркинсонизмом [3, 5, 6, 24], что имело место и у обследованного пациента — донора фибробластов, заболевшего в возрасте 19 лет.

Значение молекулярных механизмов БП, обусловленной мутациями в гене PARK2, может помочь в разработке патогенетических подходов к терапии данного варианта первичного паркинсонизма. Результаты проведенной работы показывают, что культура дофаминергических нейронов, получаемых с помощью технологии клеточного репрограммирования из фибробластов и ИПСК больных, может служить ценной моделью-биоматрицей для решения большого числа фундаментальных и прикладных задач неврологии и нейробиологии.

Работа поддержана грантом РНФ № 14−15−01047.