Рыжкова О.П.

Медико-генетический научный центр РАМН, Москва

Шаркова И.В.

Дадали Е.Л.

ФГБУ Медико-генетический научный центр РАМН, Москва

Петрунина Е.Л.

Поляков А.В.

Медико-генетический научный центр РАМН, Москва

Клинико-генетический анализ поясно-конечностной мышечной дистрофии 2 I типа

Журнал: Медицинские технологии. Оценка и выбор. ;(): 55-59

Просмотров : 18

Загрузок : 2

Как цитировать

Рыжкова О. П., Шаркова И. В., Дадали Е. Л., Петрунина Е. Л., Поляков А. В. Клинико-генетический анализ поясно-конечностной мышечной дистрофии 2 I типа. Медицинские технологии. Оценка и выбор. ;():55-59.

Авторы:

Рыжкова О.П.

Медико-генетический научный центр РАМН, Москва

Все авторы (5)

Прогрессирующая мышечная дистрофия (ПМД) 2 I типа в большинстве стран Европы является вторым по частоте встречаемости генетическим вариантом поясно-конечностной мышечной дистрофии (ПКМД) с аутосомно-рецессивным типом наследования, на долю которого приходится от 2,6 до 37% всех случаев аутосомно-рецессивных ПКМД [2, 6, 16]. Этот генетический вариант впервые описан E. Mercuri и соавт. в 2000 г. [8]. Ген FKRP, ответственный за его возникновение, расположен на длинном плече хромосомы 19 в локусе 19q13.3 и содержит 12 тыс. пар нуклеотидов (т.п.н.), структурированных в 4 экзона, один из которых кодирующий [15]. Продуктом гена является фукутин-связанный белок — фермент семейства гликозилтрансфераз, локализованный в аппарате Гольджи и синхронизирующий процессы мышечного сокращения. Белок состоит из 425 аминокислотных остатков и обеспечивает гликозилирование и посттрансляционную модификацию α- и β-дистрогликанов [4, 7]. В связи с этим, возникающие в результате мутаций в гене FKRP мышечные дистрофии предложено относить к группе дистрогликанопатий, клинические проявления которых отличаются значительным разнообразием с наличием как внутри-, так и межсемейного полиморфизма, характеризующегося варьирующими возрастом начала и тяжестью течения заболевания [1]. Тяжесть клинических проявлений четко коррелирует с возрастом манифестации заболевания. Известно, что мутации в гене FKRP могут вызывать не только ПКМД 2 I типа, возникающую после периода нормального моторного развития, но и врожденную ПМД 1 С типа [3, 5]. При этом клиническом варианте вялый парез возникает с рождения, и у большинства больных по мере прогрессирования заболевания формируются псевдогипертрофии мышц, особенно икроножных, что сочетается с нерезко выраженной задержкой темпов психоречевого развития. К отличительным чертам ПКМД 2 I типа относят преимущественное поражение проксимальных мышц конечностей, причем больше нижних, чем верхних. Часто имеет место вовлечение лицевой мускулатуры. У большинства пациентов обнаруживаются гипертрофии четырехглавой и икроножной, а также дистрофии дельтовидных и грудных мышц. Уровень креатинфосфокиназы (КФК) повышен в 10 раз и более [9, 14]. При иммунногистохимическом исследовании отмечается снижение уровней α-дистрогликана, α-2-ламинина и кальпаина-3 [13].

Ранее не проводились исследования, направленные на определение доли ПКМД 2 I типа среди всех ПКМД с аутосомно-рецессивным типом наследования в российской популяции. Изучение частоты встречаемости и клинико-генетических характеристик этих заболеваний в выборке российских больных должно способствовать созданию эффективного алгоритма диагностики, снижению затрат на проведение дорогостоящих методов ДНК-анализа. В связи с этим целью настоящего исследования явилась оценка доли ПКМД 2 I типа в выборке больных из популяции РФ и изучение особенностей ее клинических проявлений.

Материал и методы

Под наблюдением находились 74 неродственных больных, 30 мужчин и 44 женщины, в возрасте от 4 до 52 лет с клинико-электромиографическими признаками ПКМД, проживающих на территории РФ, а также 14 их клинически здоровых родственников. 6 пациентов имели подтвержденный аутосомно-рецессивный тип наследования (семейные случаи), остальные случаи заболевания были изолированными. Клиническую диагностику ПКМД проводили на основании преимущественного поражения мышц тазового и плечевого поясов, повышения уровня КФК, первично-мышечного характера поражения при электромиографии (ЭМГ), отсутствия вертикального типа наследования.

Молекулярно-генетический анализ образцов ДНК, выделенной из периферической крови пациентов, проводили в несколько этапов. Выделение геномной ДНК из лейкоцитов периферической крови осуществляли с помощью набора реактивов для выделения DNA Prep100 («DIAtom») по протоколу производителя. Амплификацию всех исследуемых фрагментов ДНК проводили методом полимеразнной цепной реакции (ПЦР) на программируемом термоциклере МС2 («ДНК-технология», Россия) в объеме 25 мл реакционной смеси. Определение нуклеотидной последовательности проводили методом прямого секвенирования продукта ПЦР как с прямого, так и обратного праймера на основе ферментативного сиквенса по Сенгеру [10]. В качестве матрицы для проведения сиквенса использовали фрагменты, полученные после проведения ПЦР. Автоматическое секвенирование проводили согласно протоколу фирмы-производителя на приборе ABI Prism 3130Xl («Applied Biosystems»). Мультиплексную лигазную реакцию (MLPA) при выявлении не описанных ранее изменений нуклеотидной последовательности проводили на программируемом термоциклере МС2 («ДНК-технология», Россия) в два этапа. На первом этапе два олигонуклеотида отжигали с исследуемой денатурированной ДНК в присутствии термостабильной ДНК-лигазы в течение 2 ч в объеме 5 мл реакционной смеси. На втором этапе проводили стандартную ПЦР с олигопраймерами, комплементарными участкам последовательностей, специально синтезированным в олигонуклеотидах. В смесь с предварительно проведенной лигазной реакцией добавляли реакционную смесь для ПЦР в объеме 15 мл. Результаты исследования регистрировали на гель-документирующей системе GelDoc 2000. Контрольную выборку составили 100 образцов ДНК (200 хромосом), полученных от неродственных жителей различных регионов РФ.

Результаты

В результате проведения молекулярно-генетического анализа ДНК из 74 неродственных больных с клиническими проявлениями ПКМД и предположительно аутосомно-рецессивным типом наследования мутации в гене FKRP, ответственном за возникновение ПКМД 2 I типа, выявлены у 8 (10,8%) пробандов. Эти результаты соответствуют данным, полученным при обследовании выборок больных из других европейских популяций. Все больные этой группы были женского пола в возрасте от 4 до 52 лет, единственными пораженными членами семьи и имели характерные признаки ПКМД, возникшие после периода нормального моторного развития. К настоящему времени описано более 60 мутаций в гене FKRP, обусловливающих развитие ПКМД 2 I типа, и более 90% из них являются однонуклеотидными заменами.

Нами обнаружено пять различных мутаций в гомо- или компаунд-гетерозиготном состоянии (табл. 1).

Таблица1
Две из них (с.341C>G и c.826C>A) были описаны ранее, а три (c.229C>T, с.265C>T, с.1078G>C) — идентифицированы впервые. В данном исследовании встретились как мутации, выявленные в единичных случаях, так и частые замены, выявленные в 3 случаях и более. Одной из частых замен являлась с.826C>A (Leu276Ile), встретившаяся у 5 (62,5%) из 8 больных, имеющих мутации FKRP. При этом у 2 (25%) больных она была выявлена в гомо-, а у 3 — в компаунд-гетерозиготном состоянии. Полученные результаты согласуются с данными литературы европейских исследователей, которые показали, что эта мутация также являлась наиболее частой причиной возникновения ПКМД 2 I типа у больных в странах Европы. При этом у 70% пациентов эта мутация была хотя бы в одном из аллелей, а у 30% — она выявлена в гомозиготном состоянии [9, 12].

Нами впервые выявлены три ранее не описанных мутации. Одна из замен с.229C>T (p.Gln77Stop), выявленная у 3 больных в компаунд-гетерозиготном состоянии с частой мутацией c.826C>A, являлась нонсенс-мутацией и не требовала дальнейшего изучения.

Две другие (c.265С>Т и c.1078С>Т) — представляли собой миссенс-мутации и требовали дальнейшего тестирования. С этой целью было проведено исследование ДНК 100 здоровых доноров (200 хромосом) методом MLPA-анализа. Изменений нуклеотидной последовательности в контрольной выборке выявлено не было, что свидетельствует в пользу того, что данные замены являются мутациями.

У 2 обследованных больных была выявлена описанная ранее как мутация замена с.341C>G (p.Ala114Gly) в гетерозиготном состоянии. С целью поиска второй мутации в гене FKRP проводили прямое автоматическое секвенирование последовательности некодирующих 1, 2, 3 экзонов с прилежащими экзонинтронными областями. Нуклеотидных замен обнаружено не было. В исследованиях европейских авторов данная замена также встречалась у больных c ПКМД 2 I типа (описано 46 случаев), причем как в гетеро-, так и гомо- и компаунд-гетерозиготном состояниях. В нескольких случаях обнаружили одновременно три замены, описанные как мутации. Две из них были с.341C>G и с.826С>A, а третья либо c.1846T>A (p.*496Argext*21), либо с.1384С>T (p.Pro462Ser). Замена с.1384С>T является миссенс-мутацией, а c.1846T>A увеличивает протяженность фукутин-связанного белка на 21 аминокислоту, благодаря модификации стоп-кодона в аминокислоту. Популяционные исследования обеих замен для определения их патогенности не проводились. По данным итальянских авторов, замена с.341C>G была выявлена на одной из 200 хромосом. Однако на данный момент все три замены во всех источниках описаны как мутации. Вероятно, у описанных больных две из них находятся в цис-положении, но, возможно, что одна из замен является полиморфизмом. При этом наличие замены с.341C>G в гетерозиготном состоянии у наших больных не противоречит диагнозу, так как используемые в настоящее время методы анализа ДНК имеют ограничения. Можно предположить, что вторая мутация находится в регуляторных областях гена, на данный момент не доступных исследованию, или является протяженной делецией, не затрагивающей участок гена, гомологичный тому, где мутация была выявлена. Наличие характерных клинических симптомов ПКМД у пациентов из различных популяций мира, имеющих замену с.341C>G, позволяет сделать предположение, что причиной развития заболевания являются мутации именно в гене FKRP.

В пользу влияния замены с.341C>G на клиническую картину может свидетельствовать схожесть таковой и у 2 больных из нашей выборки: Н-вой (11 лет) и Ч-ой (4 года) (табл. 2).

Таблица2

]]>
Заболевание манифестировало в 5 и 4 года соответственно. На момент осмотра ведущим клиническим симптомом у обеих больных являлась диффузная мышечная гипотония, выраженная больше в проксимальных отделах конечностей и мышцах тазового и плечевого поясов. Сухожильные рефлексы с нижних конечностей и карпорадиальный рефлекс не вызывались у обеих пациенток. Показатели КФК значительно превышали норму — 5394 и 4280 ед/л соответственно.

Для оценки клинического статуса пациентов на каждого больного заполняли карту фенотипа. Сводные данные об особенностях клинических проявлений ПКМД 2 I типа представлены в табл. 2. Выявлен значительный клинический полиморфизм, который касался как возраста манифестации заболевания, так и тяжести клинических проявлений. У 3 больных первые признаки заболевания отметили в возрасте 1,5 года, вскоре после начала самостоятельной ходьбы, у 2 — 4 и 5 лет, у 3 — 20 и 25 лет.

Был проведен сравнительный анализ особенностей клинических проявлений и уровней КФК у больных ПКМД 2 I типа с различными типами мутаций в гене FKRP. У 2 пациентов, имеющих распространенную мутацию 826С>А в гомозиготном состоянии, отмечалось наиболее мягкое течение заболевания, характеризующееся более поздним возрастом начала, умеренно выраженными клиническими симптомами и длительным сохранением способности к самостоятельной ходьбе. Полученный результат подтверждает данные европейских исследователей о более мягком клиническом течении заболевания у пациентов с мутацией 826С>А, особенно если она встречается в гомозиготном состоянии [11]. При наличии этой мутации в компаунд-гетерозиготном состоянии с нонсенс-мутацией 229С>Т, приводящей к прекращению трансляции белка после 77 аминокислотного остатка, тяжесть клинической картины широко варьировала. Так, у 1 больной заболевание манифестировало в возрасте 20 лет и характеризовалось умеренным прогрессированием. Пациентка полностью сохраняла не только способность самостоятельной ходьбы и самообслуживания, но и удовлетворительную трудоспособность. У 2 других больных с аналогичными мутациями в генотипе имелись клинические проявления, возникшие с момента начала самостоятельной ходьбы в возрасте 1 года, и на момент осмотра характеризовались выраженными симптомами поясно-конечностной ПМД. Одна из этих больных потеряла способность к самостоятельной ходьбе в 7-летнем возрасте.

Для демонстрации клинического полиморфизма единого генетического варианта приводим выписки из истории болезни 2 пациенток.

Больная Ф-на осмотрена в возрасте 9 лет. С начала самостоятельной ходьбы походка девочки напоминала утиную, а возрасте 1,5 года появились трудности подъема по лестнице, из положения сидя на корточках и повышенная утомляемость при ходьбе. Самостоятельно не ходит с 7 лет. На момент осмотра ведущей в клинической картине являлась диффузная мышечная гипотония, больше выраженная в проксимальных отделах конечностей, мышцах тазового и плечевого поясов. Выявлены контрактуры в голеностопных суставах и тугоподвижность — в коленных. Сухожильные рефлексы с ног не вызываются, с рук резко снижены. Мимическая и жевательная мускулатура интактна.

Пациентка Д-ая осмотрена в возрасте 26 лет по поводу жалоб на слабость и гипотрофию мышц тазового пояса, которые появились в течение последних 6 лет. Считает себя больной с 20-летнего возраста, когда возникли такие же, как и у первой пациентки, признаки заболевания. При объективном осмотре выражены «приемы миопата», увеличены в объеме икроножные мышцы. Коленные рефлексы не вызываются, ахилловы и с верхних конечностей — без патологии. Мышечная сила в тазовом поясе — 2, в плечевом — 3—4 балла. Контрактур крупных суставов не обнаружено, отмечено переразгибание в межфаланговых суставах и плоскостопие. Больная полностью сохранила трудоспособность.

При исследовании крови обе пациентки имели сходные цифры КФК — 2397 и 2686 ед./л соответственно, а также практически одинаковую длительность заболевания на момент осмотра — 7 и 6 лет соответственно.

Представляет интерес описание особенностей клинических проявлений у больной с двумя впервые выявленными нами мутациями в гене FKRP в компаунд-гетерозиготном состоянии (с.265C>T/с.1078C>T). Пробанд, больная девочка, единственный ребенок молодых здоровых родителей, осмотрена в возрасте 6 лет. Из анамнеза известно, что первые признаки заболевания появились с момента начала самостоятельной ходьбы и характеризовались переваливающейся походкой и использованием «приемов миопата» при подъеме из горизонтального положения. На момент осмотра в клинической картине выявлены умеренно выраженные признаки ПКМД, при исследовании крови уровень КФК составил 4127 ед./л.

В целом уровень КФК у всех обследованных нами больных был значительно повышен и колебался от 1590 до 5565 ед./л. Не было выявлено значимых различий в уровне активности фермента от типа мутаций.

Обсуждение

Таким образом, в обследованной выборке из 74 пациентов с клиническими проявлениями ПКМД, проживающих на территории России, мутации в гене FKRP, ответственном за развитие ПКМД 2 I типа, выявлены в 10,8% случаев. Наиболее частой мутацией является 826C>A, которая встретилась у 62,5% больных с выявленными мутациями в гене FKRP в гомо- или компаунд-гетерозиготном состоянии. Больные, у которых данная мутация обнаружена в гомозиготном состоянии, имели более мягкое течение заболевания и умеренно выраженные клинические проявления ПКМД. У больных с наличием этой мутации в компаунд-гетерозиготном состоянии с другой нуклеотидной заменой отмечался выраженный полиморфизм по возрасту начала заболевания и тяжести течения миодистрофического процесса. Интересно отметить, что половина наблюдаемых нами больных с ПКМД 2 I типа имела умеренную псевдогипертрофию икроножных мышц без увеличения их плотности на ощупь. Полученные данные не противоречат результатам исследования выборки больных из других европейских популяций, в которых псевдогипертрофии выявлены у 60—70% больных с ПКМД 2 I. Тип мутации не влияет на уровень активности КФК.

Полученные данные о доле встречаемости ПКМД 2 I типа и наличии мажорных мутаций в гене FKRP не противоречат данным европейских исследователей и являются основой для создания алгоритма обследования больных с ПКМД, манифестирующих после периода нормального моторного развития, с аутосомно-рецессивным типом наследования и в изолированных случаях. В лаборатории ДНК-диагностики Медико-генетического научного центра РАМН (Москва) разработан протокол исследования частых мутаций с.826С>A, с.229С>T и замены с.341С>T, характерных для больных из РФ, методом MLPA-анализа. Информативность данного метода — 87,5%, т.е. хотя бы одна замена будет выявлена хотя бы на одной хромосоме у 7 из 8 больных ПКМД 2 I типа.

Кроме того, при медико-генетическом консультировании необходимо учитывать существование значимого клинического полиморфизма заболеваний, обусловленных мутациями в гене FKRP. Так, наряду с изученной нами ПКМД 2 I типа, описано несколько клинических фенотипов врожденных ПМД, сочетающихся с пороками развития мозга и глаз и/или олигофренией, которые предложено обозначать как различные варианты дистрогликанопатий. Это обстоятельство необходимо учитывать при создании алгоритма обследования больных с врожденными вариантами синдромальных мышечных дистрофий.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail