Ишемический инсульт (ИИ) является многофакторным заболеванием и одной из основных причин инвалидизации и смертности во всем мире [1, 2]. Доказано, что генетические факторы вносят существенный вклад в индивидуальную чувствительность к основным факторам риска и реализацию ишемического повреждения мозга [3]. В зависимости от патогенетического варианта ИИ расчетная наследуемость колеблется от 16,1% для лакунарного инсульта до 32,6 и 40,3% для кардиоэмболического и атеротромботического инсульта соответственно [4]. Однако лежащие в основе этих влияний гены и механизмы в значительной степени неизвестны.

Недавний крупнейший метаанализ полногеномных ассоциаций (GWA), включавший 521 612 человек, выявил 22 новых локуса риска развития инсульта, в результате чего количество известных локусов, связанных с инсультом, достигло 32, включающих 149 генов. Несколько локусов показали отчетливую ассоциацию с патогенетическим подтипом инсульта. Кроме того, в ходе анализа с использованием оценок генетического риска и регрессии оценки неравновесия по сцеплению (LD) были обнаружены общие генетические вариации (18 отдельных локусов) с другой сосудистой патологией, включая артериальную гипертензию, кардиальную патологию и венозную тромбоэмболию. Одиннадцать новых локусов предрасположенности указывают на механизмы, ранее не рассматриваемые в патофизиологии инсульта. Кроме того, были выявлены локусы лекарственных мишеней для антитромботической терапии [5].

Помимо рисков развития, различные факторы, в том числе генетические, влияют на исходы ИИ [6]. Однако в отличие от самого инсульта, наши знания о генетике исхода ИИ ограничены. Было проведено всего несколько исследований GWA и обнаружены несколько локусов, ассоциированных с исходами ИИ [7, 8].

Исследования GWA имеют некоторые ограничения. Для них характерна низкая точность в определении реальных причинных вариантов или генов. Использование огромного массива дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) при условии неравновесного сцепления осложняет интерпретацию результатов GWA в клинике и требует функциональной проверки каждой ассоциации генов. Этот недостаток подчеркивает необходимость разработки новых подходов, которые могут определить причинно-следственные и биологические механизмы, лежащие в основе клинико-генетических ассоциаций.

Генетика ИИ успешно изучается на животных моделях [9]. Некоторые результаты, полученные на моделях инсульта у грызунов, были подтверждены или коррелировали с результатами ассоциативных исследований у человека, в том числе с исходами после ИИ, оцененными по GWA, но их трансляция в целом остается низкой [5]. Это связано с существенными физиологическими различиями между животными и людьми, и в ряде случаев с неадекватностью экспериментальных моделей инсульта. Помимо создания более совершенных животных моделей болезней, одним из методов улучшения трансляции данных может быть разработка подходов, основанных на тщательном отборе и межвидовой мультиомной проверке данных [10, 11]. Следуя этим принципам, нами был разработан протокол для поиска геномных маркеров, которые могут повлиять на исход ИИ, на основе биоинформационного анализа [12]. Наш метод отличается подходами к отбору как потенциальных генов-кандидатов, являющихся человеческими ортологами генов крыс, продемонстрировавших наиболее значимые изменения их экспрессии в мозге в ответ на окклюзию височной артерии, так и SNP, в том числе функционально важных SNP.

Цель исследования — изучить ассоциации 9 генетических вариантов с риском и динамикой восстановления (исход) ИИ, используя разработанный протокол для поиска геномных маркеров, основанный на биоинформационном подходе к изучению SNP в человеческих ортологах крысиных генов, дифференциально экспрессирующихся в условиях индуцированной ишемии головного мозга.

Материал и методы

Исследование проведено в группе больных с ИИ, проходивших лечение на клинической базе кафедры неврологии, нейрохирургии и медицинской генетики лечебного факультета ФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России в неврологическом отделении ГКБ №31 Москвы.

В исследование был включен 331 пациент (166 мужчин и 165 женщин, средний возраст 71,68±8,69 года) с острым впервые развившимся ИИ. В контрольную группу вошли 222 здоровых (109 мужчин и 113 женщин, средний возраст 70,20±9,63 года) русского происхождения из регионов Среднеевропейской России.

Критерии включения: наличие острого впервые возникшего ИИ; российские пациенты, которые сами идентифицировали себя как лица славянского происхождения; письменное добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

Критерии невключения: наличие транзиторной ишемической атаки, повторного ИИ, геморрагического инсульта, острого инфаркта миокарда (ОИМ), декомпенсированной сердечной недостаточности и других тяжелых сопутствующих состояний, включая аутоиммунные и инфекционные заболевания.

Все испытуемые дали письменное информированное согласие на участие в исследовании.

Подтипы ИИ были определены в соответствии с критериями TOAST [13].

Для оценки тяжести инсульта использовали шкалу инсульта Национальных институтов здоровья (NIHSS) [14]. Функциональное восстановление после инсульта оценивали по модифицированной шкале Рэнкина (mRS). Тяжесть и восстановление оценивали дважды, в 1-й и 14-й дни после инсульта. Все пациенты были обследованы согласно действующим клиническим рекомендациям по диагностике и лечению ИИ [15].

ДНК выделяли из клеток периферической крови обработкой протеиназой К с последующей экстракцией фенол-хлороформом [16]. Принципы отбора анализируемых в исследовании полиморфных маркеров описаны в недавно разработанном нами протоколе [12]. Они включали следующие основные этапы: 1) отбор генов крыс, экспрессия которых в головном мозге изменялась наиболее значительно в ответ на окклюзию височной артерии; 2) идентификация человеческих ортологов этих крысиных генов; 3) идентификация SNP в генах человека и выявление среди них любых информативных SNP с высокой степенью неравновесия по сцеплению (tagSNP). Для этого требуются данные о последовательностях всего генома из соответствующей популяции (в нашем исследовании это была популяция CEU из проекта 1000 геномов); 4) аннотирование и идентификация функционально важных tagSNP, влияющих на экспрессию изучаемых генов, а именно выраженных локусов количественных признаков (eQTL) (для аннотирования tagSNP использовалась версия GTExAnalysis V8). Аннотация привела к резкому сокращению количества генов-кандидатов, отбрасывая те, у которых был низкий потенциал. При оценке tagSNP в первую очередь отбирались SNP, связанные с изменением экспрессии соответствующих генов в тканях мозга человека. Таких SNP было восемь в пяти генах (PTX3, RGS9, EMP1, CD14 и LGALS3) (табл. 1).

Таблица 1. Геномные характеристики изученных полиморфизмов с последовательностями праймеров и зондов и условиями ПЦР

Примечание. Chr — хромосома; Ta — температура отжига; °C — градус Цельсия.

Дополнительный девятый SNP (локус rs1491961 в CCR1) был включен в анализ на основании его значимой статистики, связанной с eQTL. Он имел наибольшее абсолютное значение p и нормализованную величину эффекта (10—47 и –0,40 соответственно), а его функциональный эффект был связан с экспрессией в цельной крови. Выбранные SNP-метки были генотипированы в текущем исследовании с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени TaqMan. Праймеры и зонды для распознавания аллелей были разработаны с использованием программного обеспечения BeaconDesigner v. 7.91 («PREMIER Biosoft International», США) и синтезированы компанией «ДНК-Синтез» (Россия) (см. табл. 1).

ПЦР проводили в водном растворе конечным объемом 25 л, содержащем 2,5 л буфера 10 ПЦР («Синтол», Россия), 2,5 мМ MgCl2 («Силекс», Россия), 250 М дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (ЗАО «ThermoFisherScientificBaltics», Литва), по 10 пМ праймеров («ДНК-Синтез», Россия), 5 пМ FAM- и VIC-специфических зондов TaqMan («ДНК-Синтез», Россия), 1,25 ед. ДНК-полимеразы SynTaq («Синтол», Россия) и 50 нг геномной ДНК. Термоциклирование и измерение интенсивности флюоресценции проводили с использованием системы ПЦР в реальном времени StepOnePlus (Applied Biosystems, США). Образцы сначала инкубировали в течение 10 мин при 95 °C для активации ДНК-полимеразы SynTaq, потом циклировали 40 раз при 95 °C в течение 15 с, а затем при 54—62 °C в течение 45 с (см. табл. 1).

Статистический анализ. Влияние SNP на восстановление оценивали по их связи с показателями шкалы mRS. Баллы были проанализированы следующим образом: 1) баллы mRS 0—2 по сравнению с баллами 3—6 (исследование 1); 2) баллы mRS 0—3 по сравнению с баллами 4—6 (исследование 2); 3) динамика показателей mRS с 1-го по 14-й день после ИИ (исследование 3). Первые два исследования различались по уровню помощи, необходимой пациентам в повседневной жизни: 1) оценка mRS 0—2 балла (группа функционального восстановления) против 3—6 баллов (группа нефункционального восстановления) и 2) способность пациентов ходить (по шкале mRS 0—3 балла (группа функционального восстановления) против mRS 4—6 баллов (группа нефункционального восстановления). Исследование 3 было проведено для оценки различий в постинсультных исходах. Их оценивали путем расчета индивидуальных изменений (значений D) в баллах mRS у пациентов на 1-й и 14-й дни как DmRS=mRS1—mRS14 и определяли как положительные (DmRS>0), отрицательные (DmRS<0) или стабильные (DmRS=0). Распределение генотипов в группах сравнивали с помощью теста χ2. При необходимости уточнения вклада отдельных генотипов дополнительно применялись доминантные, рецессивные и сверхдоминантные генетические модели. Для нахождения независимых переменных использовали множественную линейную регрессию. Результаты были скорректированы по возрасту и полу. Значимость ассоциаций была установлена на уровне p<0,005, которая рассчитывалась как номинальное значение (p<0,05), деленное на общее количество протестированных SNP (n=9). Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения Statistica v. 8.0, R-пакета AssocTests и программного обеспечения Haploview v. 4.2 [17].

Результаты

В текущем исследовании было генотипировано девять SNP. Частоты генотипов по исследуемым группам приведены в табл. 2 и 3. Распределения всех генотипов в контрольных выборках не отклонялись от ожидаемых значений при равновесии Харди—Вайнберга. Два SNP показали значительную связь с риском развития инсульта: rs62278647 и rs2316710 (см. табл. 3). Оба SNP принадлежат гену PTX3 и находились в сильном LD в нашей выборке (r²=0,82). Объединение информации о распределении генотипов по генетическим моделям наследования (доминантная, рецессивная и сверхдоминантная) показало наиболее выраженную ассоциацию с гетерозиготным генотипом AT у пациентов (p=0,000027). В случае SNP rs2316710 такая распространенность также наблюдалась, но не была достоверной (p=0,0095). По результатам регрессионного анализа SNP rs62278647 был единственным независимым предиктором развития ИИ. Дополнительные сравнения, проведенные отдельно в когортах мужчин и женщин, показали, что обнаруженные ассоциации были значимы только у женщин (p=0,000057 и p=0,000765 для rs62278647 и rs2316710 соответственно). Обе ассоциации оставались значимыми даже после поправки на количество двух дополнительных сравнений (p<0,0056/2). Для других SNP не наблюдалось статистически значимых различий в распределении генотипов между когортами мужчин и женщин.

Таблица 2. Частота генотипов в группах пациентов из исследований 1, 2 и 3

Примечание. Здесь и в табл. 3: цифры в скобках — число пациентов с определенными генотипами; p — статистическая значимость; * — различия статистически значимы.

Таблица 3. Частота генотипов в группах больных и контроля

Помимо ассоциации с риском развития ИИ, была проанализирована возможность ассоциации представленных SNP с динамикой функционального восстановления в остром периоде ИИ. Из 331 пациента с инсультом, проанализированного в исследовании 1, 116 были классифицированы как группа функционального восстановления (оценка по шкале mRS 0—2 балла), а 214 — группа нефункционального восстановления (оценка по шкале mRS 3—6) (1 пациент был исключен из анализа в связи со смертью на 8-е сутки заболевания). В исследовании 2 группа функционального восстановления включала 175 пациентов (оценка mRS 0—3 балла), а нефункционального восстановления — 155 (оценка mRS 4—6 баллов). У 155 пациентов отмечена положительная динамика изменений показателей mRS (DmRS >0 баллов); у 67 — негативные изменения (DmRS <0 баллов); 108 пациентов были стабильны (DmRS=0 баллов) (см. табл. 2). Статистически значимых различий в распределении генотипов между группами в исследованиях 1 и 2 обнаружено не было. В то же время анализ распределений генотипов, наблюдаемых в исследовании 3, выявил один достоверно значимый SNP (p<0,05): rs66782529 гена LGALS3 (см. табл. 2). Дополнительные попарные сравнения доказали, что в группе пациентов с отрицательной динамикой (DmRS<0 баллов) генотип CC встречался достоверно чаще по сравнению с группой положительной динамики и отсутствием динамики. Ассоциация была наиболее значимой при сравнении групп с отрицательными и стабильными значениями DmRS, где rs66782529 был независимым предиктором плохой динамики восстановления ИИ в остром периоде (p=0,0047 по сравнению с p=0,9235 и p=0,3071 для пола и возраста соответственно).

Обсуждение

Исходы ИИ варьируют от полного выздоровления до стойкой тяжелой инвалидности или смерти. В ходе исследования нами были оценены ассоциации генетических вариантов в шести генах с динамикой восстановления в остром периоде инсульта. Как указывалось ранее, выбор SNP, в том числе функционально важных SNP, был основан на определении человеческих ортологов генов крыс, продемонстрировавших наиболее значимые изменения их экспрессии в мозге в ответ на окклюзию височной артерии. Наш анализ был проведен среди пациентов, идентифицирующих себя как русских, для создания группы с гомогенным с точки зрения генетики происхождением.

Традиционно исходы анализируются путем разделения пациентов на группы функционального и нефункционального восстановления на основе индивидуальных показателей шкалы mRS (т.е. противопоставленные группы могут включать пациентов с показателями mRS 0—2 и 3—6 баллов или с показателями mRS 0—3 и 4—6 баллов). Также нами были разделены пациенты на основе динамики и направления изменений их показателей восстановления mRS с 1-го по 14-й дни. В результате этого группирования были выделены 3 разные категории динамики — положительная, отрицательная и стабильная. Результаты регрессионного анализа показали меньшую зависимость предложенной группировки от возраста больных и позволили предположить, что она может быть альтернативой другим вариантам разделения больных при изучении исходов инсульта.

Связи между исследуемыми SNP и функциональным восстановлением в остром периоде, оцениваемым по шкале mRS, обнаружено не было. Однако было обнаружено, что один локус SNP (rs66782529) гена LGALS3 достоверно коррелирует (p<0,05) с отрицательными значениями динамики восстановления. Этот SNP удален от начала гена LGALS3 на 8 т.п.н., но, следуя формальным критериям, мы аннотировали его этим геном. LGALS3 кодирует белок, связывающий бета-галактозид, галектин-3, который участвует в регуляции или опосредовании различных внутри- и внеклеточных процессов, включая клеточную адгезию, миграцию, дифференцировку, апоптоз и воспаление [18]. Галектин-3 повсеместно экспрессируется у взрослых людей в нормальных физиологических условиях. Также было обнаружено, что его экспрессия значительно и быстро индуцируется в условиях болезни. Поэтому галектин-3 считается важным биомаркером, особенно сердечно-сосудистых и цереброваскулярных заболеваний [19, 20]. Этот потенциал связан с провоспалительными свойствами белка. Роль галектина-3 в опосредовании воспалительных реакций во время подострого инсульта у крыс была продемонстрирована посредством реверсии нейровоспаления при ингибировании экспрессии LGALS3 [21]. С учетом данных проекта Genotype-TissueExpression (GTEx), продемонстрировавшего способность генотипов rs66782529 влиять на экспрессию LGALS3 в головном мозге, результаты нашего исследования согласуются с данными литературы. Во-первых, согласно исследованию GTEx, генотипы CT и TT снижали экспрессию. Во-вторых, максимальное число больных с генотипом CC наблюдалось в группе с отрицательными значениями DmRS. В этой группе снижение функциональных возможностей не было остановлено или обращено вспять. Следовательно, у этих пациентов могло быть задействовано нейровоспаление как фактор дальнейшего повреждения головного мозга. Кроме того, при рассмотрении функциональных особенностей SNP rs66782529 по результатам HaploReg [22] и RegulomeDB [23] следует отметить, что SNP влияет на экспрессию LGALS, изменяя локальное состояние хроматина.

Кроме того, достоверные ассоциации были обнаружены между SNP гена PTX3 и риском развития ИИ. Ген кодирует белок пентраксин-3, который является важным медиатором врожденной устойчивости к различным патогенам грибкового, бактериального и вирусного происхождения и участвует в регуляции воспаления, ангиогенеза, ремоделирования тканей и опухоли [24]. Как и в случае с LGALS3, экспрессия PTX3 увеличивается при болезненных состояниях, а пентраксин-3 был определен как новый и независимый прогностический маркер смертности после ОИМ и ИИ [25, 26]. В то же время эксперименты на животных моделях показали, что истощение PTX3 приводило к поведенческим нарушениям и прогрессированию повреждения головного мозга у мышей с хронической ишемией, свидетельствуя, что пентраксин-3 может действовать в зависимости от времени, усиливая воспаление сразу после повреждения и способствуя процессам репарации тканей в более поздние сроки [27—29].

В нашем исследовании было обнаружено, что SNP гена PTX3 связаны с риском ИИ (rs62278647 и rs2316710). Риск ИИ в целом коррелировал с преобладанием гетерозиготных генотипов у наших пациентов. Аналогичная направленность ассоциации была продемонстрирована в исследовании E. el Melegy и соавт. [30], которые изучали ассоциацию SNP rs2305619 с ОИМ. SNP rs2305619 находился в сильном неравновесии по сцеплению (LD; r²=0,97) с нашим SNP rs2316710 в тестовой популяции CEU из проекта 1000 Genomes [9]. При этом каких-либо корреляций PTX3 с функциональным восстановлением при остром инсульте обнаружено не было. Мы предполагаем, что отсутствие корреляции между полиморфизмами PTX3 и исходом ИИ связано с тем, что сам уровень PTX3 не является причинным фактором для исхода ИИ. Полученные в ходе исследования данные о различиях генотипических ассоциаций с риском ИИ между пациентами мужского и женского полов усложняют вопрос, предполагая возможность половой специфичности функции PTX3, в том числе ее корреляцию с более высокой частотой ИИ у женщин. Однако это предположение требует подтверждения в дальнейших исследованиях.

Заключение

Подводя итоги работы, можно сделать вывод, что разработанный нами подход к поиску генетических маркеров исхода ИИ, основанный на определении потенциальных генов-кандидатов, являющихся человеческими ортологами генов крыс, продемонстрировавших наиболее значимые изменения экспрессии в мозге в ответ на окклюзию височной артерии, в том числе функционально важных SNP, оказался эффективным. Был выявлен ряд новых ассоциаций с риском развития и динамикой функционального восстановления острого инсульта. В то же время исследование имело некоторые ограничения. Во-первых, относительно небольшой размер выборки, который мог снизить статистическую мощность исследования. Во-вторых, так как анализ был ограничен локальными eQTL, потенциальные ассоциации удаленных SNP (транс-eQTL) с инсультом и постинсультными событиями не учитывались. Принятие во внимание этих факторов повысит возможности и силу нашего подхода.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (Российский фонд фундаментальных исследований) в рамках научного проекта №19-04-00397.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.