Наряду с изучением роли клеточного и гуморального иммунного ответа в патогенезе рассеянного склероза (РС) участие врожденной иммунной системы также привлекает большое внимание [1]. Дендритные клетки являются важным звеном врожденного иммунного ответа и являются наиболее эффективными антигенпрезентирующими клетками, способными не только активировать наивные Т-лимфоциты, но и направлять их дифференцирование в различные адаптивные субпопуляции, обладающие про- или противовоспалительными свойствами [2]. Способность дендритных клеток как индуцировать аутоиммунное воспаление, так и поддерживать иммунологическую толерантность показана in vitro и на экспериментальных моделях in vivo, что указывает на существенное значение дендритных клеток в патогенезе различных аутоиммунных заболеваний [2]. На участие дендритных клеток в патогенезе РС также указывает прямое или косвенное влияние препаратов патогенетической терапии РС на их функции [3].

Исследование иммуномодулирующего эффекта биогенных аминов как прямых медиаторов нейроиммунного взаимодействия является перспективным направлением в изучении патогенеза РС. Показано участие дофамина, норадреналина и серотонина в модуляции Th17-иммунного ответа, играющего важное патогенетическое значение при РС [4, 5]. В то же время влияние нейротрансмиттеров на функции дендритных клеток, способных индуцировать развитие Th17-клеток, изучено недостаточно.

Цель исследования — изучить влияние селективного ингибитора обратного захвата серотонина (СИОЗС) флуоксетина на продукцию дендритными клетками цитокинов интерлейкина-6 (ИЛ-6) и интерлейкина-1β (ИЛ-1β), которые являются необходимыми факторами для развития Th17-клеток и играют важную провоспалительную роль в патогенезе РС.

Материал и методы

Проведено комплексное клиническое и иммунологическое обследование 5 больных (3 женщины и 2 мужчины) в возрасте от 25 до 35 лет (медиана возраста 28 лет) с достоверным диагнозом «ремиттирующий РС» по критериям МакДональда в модификации 2010 г. [6]. Длительность заболевания на момент включения в исследование составляла от 2 до 5 лет (медиана 4 года). Все больные >1 года получали патогенетическую терапию препаратом глатирамера ацетат (20 мг п/к ежедневно). Все больные находились в стадии клинической ремиссии. Всем пациентам проводился стандартный неврологический осмотр с оценкой уровня инвалидизации по шкале Expanded Disability Status Scale (EDSS) (уровень инвалидизации составил от 1 до 2 баллов) [7]. На момент забора крови все исследуемые >3 мес не получали лечение кортикостероидной терапией и терапией антидепрессантами. Контрольную группу составили 5 условно здоровых доноров, сопоставимых по полу и возрасту с группой больных РС (3 женщины и 2 мужчины в возрасте от 25 до 35 лет).

Для получения незрелых дендритных клеток из венозной крови (взятой в утренние часы в пластиковую пробирку с гепарином) выделяли мононуклеарные клетки периферической крови (МНКПК) путем центрифугирования на градиенте плотности фиколл-урографина («ПанЭко», Россия), трижды отмывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ, pH7,3) и ресуспендировали в культуральной среде RPMI 1640 («Life Technologies», США) с добавлением 2 mM L-глутамина («ПанЭко», Россия) и 2% человеческой AB сыворотки («PAA», Австрия) (полная культуральная среда (ПКС)). Далее из МНКПК путем магнитной сортировки клеток выделяли моноциты (негативная селекция; «Miltenyi Biotec», Германия), которые затем культивировали с рекомбинантным человеческим гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (80 нг/мл) и интерлейкином-4 (50 нг/мл) («Miltenyi Biotec», Германия) в течение 6 сут, получая незрелые дендритные клетки [8].

Для анализа продукции цитокинов незрелые дендритные клетки высевали в 96-луночные плоскодонные планшеты по 40 тыс. клеток на 200 мкл среды на лунку («SPL Life Sciences», Республика Корея). Затем в течение 2 ч клетки преинкубировали с 100 МЕ интерферона-γ (ИФН-γ) («Becton Dickinson», США) при +37 °C в атмосфере 5% CO₂, после чего вносили липополисахарид (ЛПС) в конечной концентрации 100 нг/мл [9]. В отрицательный контроль вместо ИФН-γ и ЛПС вносили эквивалентный объем культуральной среды. Далее планшеты инкубировали при +37 °C в атмосфере 5% CO₂ в течение 24 ч, после чего отбирали супернатант и замораживали при –70 °С.

Для оценки влияния флуоксетина на продукцию ИЛ-6 и ИЛ-1β образцы дендритных клеток также стимулировали в присутствии флуоксетина («Tocris», Швейцария) в конечной концентрации 10^–6 М [10]. Для изучения рецепторов, способных опосредовать иммуномодулирующий эффект флуоксетина, дендритные клетки были преинкубированы в течение 15 мин в присутствии антагонистов 5-HT_1A-(NAD 299), 5-HT_2A-(MDL 100907), 5-HT_2B-(RS 127445) рецепторов или агониста 5-HT_2B-(BW 723C86) рецепторов («Tocris», Швейцария) в конечной концентрации 10^–6 М, после чего в клетки вносили флуоксетин и стимулировали по вышеописанной схеме.

Уровни спонтанной и индуцированной продукции ИЛ-6 и ИЛ-1β в супернатантах клеточной культуры определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА). Для измерения концентрации цитокинов использовали наборы фирмы «Вектор-Бест» (Россия). Уровни аналитов выражали в пг/мл или в процентах по отношению к стимулированной продукции цитокинов.

Все исследуемые подписали информированное согласие на участие в данном исследовании. Проведение исследования было одобрено этическим комитетом Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И. Пирогова (протокол №192).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Prizm 6. Для оценки различий между двумя независимыми группами использовали U-критерий Манна—Уитни. Статистически значимыми различия считались при p<0,05.

Результаты

Согласно данным ИФА, спонтанная и ЛПС-стимулированная продукция ИЛ-6 и ИЛ-1β была сопоставима в обеих группах (см. таблицу). Внесение флуоксетина оказало ингибирующий эффект на продукцию как ИЛ-6, так и ИЛ-1β в обеих группах (см. рисунок, а—г). Блокада 5-HT_2B-рецепторов специфическим антагонистом RS 127445 снижала выраженность ингибирующего эффекта флуоксетина на продукцию ИЛ-1β в обеих группах (см. рисунок, в, г) и ИЛ-6 в группе здоровых доноров (см. рисунок, б) (в присутствии антагониста 5-HT2B-рецепторов ингибирующий эффект флуоксетина на продукцию цитокинов не был достоверным). Активация 5-HT_2B-рецепторов специфическим агонистом (BW 723C86), напротив, усиливала ингибирующий эффект флуоксетина на продукцию дендритными клетками ИЛ-6 в обеих группах (см. рисунок, а, б), но не изменяла эффект флуоксетина на продукцию ИЛ-1β (см. рисунок, в, г). Блокада 5-HT1A- и 5-HT2A-рецепторов специфическими антагонистами NAD 299 и MDL 100907 соответственно не оказала влияния на ингибирующий эффект флуоксетина на продукцию цитокинов (см. рисунок, а—г).

Продукция ИЛ-6 и ИЛ-1β дендритными клетками больных РС и здоровых контролей. Представлено значение медианы, в скобках — 25-й и 75-й процентили

Влияние флуоксетина на продукцию ИЛ-6 (а, б) и ИЛ-1β (в, г) дендритными клетками больных РС и здоровых доноров in vitro.

Дендритные клетки (в количестве 40 000 в 200 мкл на лунку), полученные от больных РС и группы здоровых доноров, были стимулированы ЛПС в присутствии/отсутствии флуоксетина (10^–6 М) с или без предварительной инкубации с антагонистами 5-HT_1A (NAD 299)-, 5-HT_2A (MDL 100907)-, 5-HT_2B (RS 127445)-рецепторов (10^–6 М) или агонистом 5-HT_2B (BW 723C86)-рецепторов (10^–6 М). После 24-часовой инкубации в CO₂-инкубаторе в супернатантах клеточной культуры определяли уровни продукции ИЛ-6 и ИЛ-1β методом ИФА. Данные представлены в виде процентов по отношению к ЛПС-стимулированной продукции цитокинов. Горизонтальная линия в боксе обозначает значение медианы, символы — значения.

Обсуждение

Наличие дендритных клеток в центральной нервной системе (ЦНС), а также путей сообщения между ЦНС и глубокими шейными лимфатическими узлами посредством лимфатической системы и лимфатических сосудов твердой мозговой оболочки мозга позволяет рассматривать дендритные клетки в качестве кандидатов на роль первичных инициаторов аутоиммунного воспаления в ЦНС [11—13]. Таким образом, модуляция функций дендритных клеток, в особенности в ЦНС, — важная задача для патогенетической терапии РС.

В этом аспекте биогенные амины, рецепторы к которым экспрессируются дендритными клетками, привлекают наибольшее внимание. В проведенных ранее исследованиях было показано влияние дофамина, норадреналина и серотонина на функции дендритных клеток, в том числе на способность дендритных клеток индуцировать патогенетически значимый при РС Th1- и Th17-иммунный ответ [14—16]. Флуоксетин относится к препаратам группы СИОЗС, однако также обладает иммуномодулирующим свойством. Установлено, что флуоксетин может модулировать функции клеток врожденной и адаптивной иммунной системы, а также смягчать течение экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита у животных [17, 18]. Обсуждается терапевтический потенциал флуоксетина в качестве дополнительной патогенетической терапии РС. Было показано, что СИОЗС не только оказывают профилактическое действие на связанные со стрессом обострения РС (эсциталопрам), но также способны подавлять МРТ-активность заболевания (флуоксетин) [17, 19, 20].

Согласно полученным в данном исследовании результатам, флуоксетин снижает продукцию дендритными клетками провоспалительных цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-1β как у больных РС, так и у здоровых доноров (см. рисунок, а—г), что согласуется с данными других исследователей и подтверждает противовоспалительный эффект флуоксетина [10]. В то же время механизмы, опосредующие этот эффект, до конца не ясны. Одним из таких механизмов может быть активация серотониновых рецепторов на дендритных клетках. По данным M. Idzko и соавт. [21], дендритные клетки человека экспрессируют 5-HT_1B-, 5-HT_1E-, 5-HT_2А-, 5-HT_2B-, 5-HT₃-, 5-HT₄-, и 5-HT₇-рецепторы. Нами не было обнаружено изменения эффекта флуоксетина на продукцию цитокинов на фоне предварительной блокады 5-HT1A- и 5-HT2A-рецепторов (см. рисунок, а—г). В то же время блокада 5-HT2B-рецепторов снижала ингибирующий эффект флуоксетина на продукцию ИЛ-1β в обеих группах (см. рисунок, г, д) и ИЛ-6 в группе здоровых доноров (см. рисунок, б), что указывает на то, что ингибирующий эффект флуоксетина на продукцию ИЛ-6 и ИЛ-1β может быть опосредован активацией 5-HT_2B-рецепторов. Напротив, предварительная активация 5-HT_2B-рецепторов специфическим агонистом усиливала ингибирующий эффект флуоксетина на продукцию цитокинов дендритными клетками, что также подтверждает участие 5-HT_2B-рецепторов в механизме действия флуоксетина (см. рисунок, а, б).

Полученные результаты с использованием агониста 5-HT_2B-рецепторов согласуются с результатами других исследователей. В исследовании A. Szabo и соавт. [22] было установлено, что стимуляция 5-HT_2B-рецепторов с использованием агониста BW 723C86 (без последующего культивирования с флуоксетином) подавляет активацию человеческих CD1a⁺-дендритных клеток человека и снижает продукцию ими ИЛ-6, ИЛ-8 и ИЛ-12. Также была обнаружена сниженная способность таких дендритных клеток индуцировать Th1- и Th17-иммунный ответ. Однако нет данных, описывающих дальнейшие изменения в клеточном метаболизме, которые могли бы объяснить связь активации 5-HT_2B-рецепторов с подавлением выработки провоспалительных цитокинов.

Другим вероятным механизмом противовоспалительного эффекта флуоксетина может быть повышение уровня внутриклеточного серотонина в дендритных клетках. В то же время и этот механизм действия нуждается в уточнении, так как само влияние серотонина на функции дендритных клеток противоречиво. По данным одних авторов, серотонин может оказывать различный эффект на продукцию дендритными клетками провоспалительных цитокинов, в частности подавлять ИЛ-12p70, ИЛ-6, но стимулировать ИЛ-1β, по данным других — стимулировать ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-8, но не ИЛ-12p70 и ИЛ-1β, тогда как описанные иммуномодулирующие свойства флуоксетина указывают прежде всего на его противовоспалительные эффекты [17, 21, 23]. Рецепторы серотонина связаны преимущественно с G-белками и в зависимости от типа рецептора способны повышать или уменьшать уровень циклического аденозинмонофосфата (цАМФ), в результате чего активация различных типов серотониновых рецепторов способна вызывать различные эффекты. В этом случае важным фактором является афинность рецепторов, но этот вопрос также остается неизученным.

Полученные данные в совокупности с результатами других исследований позволяют говорить о возможных перспективах СИОЗС в качестве патогенетической терапии РС. Однако дальнейшие исследования с целью уточнения иммунных механизмов действия этих препаратов необходимы.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта №18-315-00436.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.