Экспериментальное обоснование метода тканевой инженерии для закрытия стойких перфораций барабанной перепонки

В настоящее время активно изучается возможность внедрения методов тканевой инженерии в клиническую практику. В частности, приемы регенеративной медицины активно используются в стоматологии, урологии, пластической хирургии и кампустиологии [1—3]. Согласно основному тканеинженерному принципу, для регенерации тканей необходимо взаимодействие трех базовых компонентов: полипотентных клеток, скаффолда и регуляторных факторов [4]. Скаффолд представляет собой специальную основу для регенерации, физические свойства которой аналогичны свойствам восстанавливаемой ткани. В роли регуляторных факторов, индуцирующих пролиферацию и миграцию клеток, чаще всего выступают факторы роста.

Имеются данные ряда исследователей о наличии в области фиброзного кольца и рукоятки молоточка фибробластов, что свидетельствует об эндогенном регенеративном потенциале барабанной перепонки [5, 6]. Ключевая проблема заживления дефектов барабанной перепонки заключается в отсутствии соединительнотканной основы, по которой происходил бы рост эпителия [7].

Так, отсутствие поддерживающей опоры при наличии прогениторных клеток и локальных факторов, способствующих их пролиферации и миграции, приводит к подворачиванию эпидермиса за край дефекта и возникновению стойкой перфорации.

Эндогенный регенеративный потенциал барабанной перепонки позволяет использовать так называемую тканевую инженерию in situ — метод, предполагающий применение лишь двух компонентов — скаффолда и регуляторного фактора для эффективного закрытия стойкой перфорации [8].

Цель исследования — экспериментальное обоснование применения метода тканевой инженерии для закрытия стойкого дефекта барабанной перепонки.

Первым этапом необходимо было добиться формирования стойкой перфорации барабанной перепонки у экспериментальных животных. С этой целью использовали 12 взрослых самцов шиншилл. Наружный слуховой проход у взрослых самцов животных достаточно широкий, что позволяет проводить манипуляции на барабанной перепонке при постоянном визуальном контроле с помощью жесткого эндоскопа 4 мм. При предварительном изучении особенностей наружного уха шиншилл было определено, что диаметр барабанной перепонки шиншилл 7—10 мм, строение барабанной перепонки, а также цепи слуховых косточек аналогично таковым у человека.

Для создания стойкого дефекта под контролем микроскопа в миринготомическое отверстие после подворачивания краев дефекта устанавливали тимпаностомическую трубку на срок 4 нед, после чего трубку удаляли. В течение 8 нед наблюдали за формированием стойкой перфорации барабанной перепонки. Формирования стойкого дефекта барабанной перепонки с обеих сторон удалось достичь у всех 12 животных. Дефект локализовался в задненижних квадрантах барабанной перепонки, диаметр отверстия составлял 3—4 мм.

Вторым этапом мы проводили закрытие созданной стойкой перфорации барабанной перепонки. Двенадцать правосторонних перфораций были разделены на две равные группы (1-я и 2-я). В 1-й группе (n=6) закрытие дефекта производили тканеинженерным методом in situ с применением коллагенового скаффолда и рекомбинантного основного фактора роста фибробластов (далее — bFGF). Фактор роста фибробластов представляет собой гепарин-связывающий белок, который активирует миграцию и пролиферацию клеток фибробластического дифферона, а также ангиогенез, активно участвуя в репарации тканей [9]. Препарат наносили на предварительно вырезанную по размерам дефекта коллагеновую губку, которую устанавливали над перфорацией таким образом, чтобы она перекрывала ее на 1—2 мм. Коллагеновая губка широко используется в медицине и способствует эффективному заживлению поврежденных тканей, согласно многочисленным исследованиям [10, 11].

Во 2-й группе (n=6) ростовые факторы для закрытия дефекта барабанной перепонки не использовались, дефект закрывался коллагеновой губкой, пропитанной физиологическим раствором (NaCl, 0,9%).

В обеих группах поверх коллагеновой губки наносили фибриновый клей. Операции в описанных 1-й и 2-й группах животных выполнены на правых барабанных перепонках (N12).

Все 12 левосторонних перфораций использовались для контрольного наблюдения и были включены в 3-ю группу (n=12). Искусственного закрытия перфораций в этой группе не было.

Период наблюдения за животными составлял 12 нед. Для оценки сроков закрытия перфорации барабанной перепонки мы проводили отовидеоэндоскопию каждые 2 нед во всех трех группах.

У животных 1-й и 2-й групп через 2 нед после лечения удаляли коллагеновую губку. В случае неполного закрытия дефекта процедуры повторялись по описанной выше методике.

После полного закрытия перфорации животное выводили из эксперимента для последующего проведения гистологического исследования восстановленной барабанной перепонки.

В 1-й группе через 2 нед мы наблюдали полное закрытие дефекта у всех (100%) животных. Во 2-й группе полное закрытие перфорации отметили у 1 животного лишь после трехкратного повторения процедуры. У остальных животных перфорация оставалась стойкой даже после трех процедур. В 3-й группе (n=12) за период наблюдения у 1 животного через 4 нед отмечено гноетечение. Спонтанного закрытия дефекта барабанной перепонки у животных этой группы установлено не было.

При проведении отомикроскопии в 1-й и 2-й группах мы оценивали структуру регенерата — участка барабанной перепонки, восстановленного в результате проведенных процедур.

У животного из 2-й группы с полностью затянувшимся дефектом на месте перфорации определялся полупрозрачный рубец, умеренно втянутый в барабанную полость. У всех животных 1-й группы втяжения и других видимых отличий между восстановленным участком и нативной барабанной перепонкой при отомикроскопии мы не обнаружили.

Для понимания особенностей микроскопического строения структур проведено гистологическое исследование поперечного среза нативной барабанной перепонки здоровой шиншиллы.

Для этого использовали следующие методы: оптическую микроскопию, фазово-контрастную и поляризационную микроскопию, увеличение 400х. Наружная сторона барабанной перепонки выстлана многослойным плоским эпидермальным эпителием, содержащим 6—7 слоев клеток, характерные для кожи слои не выражены, а на поверхности определяется тонкий слой кератина. Внутренняя поверхность барабанной перепонки выстлана одно-двуслойным эпителием. Между эпителиальными слоями располагается фиброзный слой, состоящий из фибробластов и коллагеновых волокон. Веретеновидные фибробласты в наружном слое под эпидермисом срезаны в основном поперек, что говорит об их продольной ориентации, также ориентированы и коллагеновые волокна, а во внутреннем слое — продольно, что соответствует их циркулярному расположению (см. рис. 1 на цв. вклейке).

Рис. 1. Световая микроскопия поперечного среза нативной барабанной перепонки.

Окраска Г-Э, ув. 400.

Аналогичные исследования выполнены у испытуемых животных. При микроскопическом исследовании барабанной перепонки в 1-й группе на месте дефекта обнаружена плотная, местами разрыхленная, фиброзная соединительная ткань, в плотных участках видны коллагеновые пучки, которые состоят из плотно прилегающих друг к другу коллагеновых волокон (см. рис. 2, а, на цв. вклейке).

Рис. 2. Микроскопическое исследование поперечного среза регенерата барабанной перепонки из 1-й группы.

Окраска Г-Э, ув. 400. а — световая микроскопия; б — фазово-контрастная микроскопия; в — поляризационная микроскопия.

При фазово-контрастной микроскопии регенерата отчетливо прослеживалась волокнистая структура пучков (см. рис. 2, б, на цв. вклейке ). Клеточные элементы в этих плотных пучках представлены в основном фибробластами, как правило, срезанными поперек, т.е. имеющими продольное расположение.

При поляризационной микроскопии коллагеновые волокна дают анизотропию, более выраженную в плотных пучках (см. рис. 2, в, на цв. вклейке).

Однако в этой фиброзной мембране есть участки разрыхления коллагеновых структур (см. рис. 3, а, на цв. вклейке). В этих участках коллагеновые волокна в пучках разрыхлены, хотя отдельные пучки остаются плотными.

Рис. 3. Микроскопическое исследование поперечного среза регенерата барабанной перепонки из 1-й группы в области разрыхления коллагеновых волокон.

Окраска Г-Э, ув. 400. а — световая микроскопия; б — поляризационная микроскопия; в — фазово-контрастная микроскопия.

При поляризационной микроскопии четкую анизотропию дают только плотные пучки, а в рыхлой соединительной ткани анизотропия слабая или отсутствует (см. рис. 3, б, на цв. вклейке).

При фазово-контрастной микроскопии четко выявляется волокнистость в рыхлой зоне (см. рис. 3, в, на цв. вклейке).

Следует отметить, что полноценная регенерация эпителиальных выстилок обнаруживалась не во всех регенератах из 1-й группы. Так, у 2 из 6 животных местами отмечался рост эпителия лишь с наружной стороны регенерата, как правило, однослойного, местами переходящего в многослойный, но менее зрелый, чем в нормальной ткани.

При гистологическом исследовании восстановленной барабанной перепонки 2-й группы на месте дефекта обнаружена мембрана, представленная двумя слоями — фиброзным и эпителиальным (см. рис. 4 на цв. вклейке).

Рис. 4. Микроскопическое исследование поперечного среза регенерата барабанной перепонки из 2-й группы.

Окраска Г-Э, ув. 400. а — участок разрыхления коллагеновых волокон с очаговой лимфо-макрофагальной инфильтрацией.

В фиброзной мембране коллагеновые волокна в пучках разрыхлены. Важно отметить, что в участках выраженного разрыхления фиброзного слоя отмечаются умеренный отек и очаговая лимфо-макрофагальная инфильтрация (см. рис. 4, а, на цв. вклейке).

По данным гистологического исследования, структура регенератов из 1-й группы в целом соответствовала макро- и микроструктуре нативной барабанной перепонки. Восстановление трехслойной структуры барабанной перепонки мы наблюдали только в барабанных перепонках, восстановленных тканеинженерным способом.

Тканеинженерный метод in situ с использованием коллагенового скаффолда и основного фактора роста фибробластов является эффективным ввиду полного закрытия стойкой перфорации барабанной перепонки, что также подтверждается данными гистологического исследования, где отмечается приближенное к норме восстановление среднего слоя перепонки без выраженной очаговой инфильтрации.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.