Объективизация оценки донорского материала для сквозной пересадки роговицы

Авторы:

Мамиконян В.Р.,

Григорий Альбертович Осипян,

Догузов В.А.,

Розинова В.Н.,

Щукина Т.И.,

Х. Храйстин

Журнал: Вестник офтальмологии. 2017;133(6):76-82.

DOI: 10.17116/oftalma2017133676-82

Прочитано: 1389 раз

Скачать PDF

Резюме

При сквозной пересадке роговицы важнейшей задачей является правильная оценка пригодности донорского материала. Основным показателем при этом является плотность эндотелиальных клеток (ПЭК). Однако необходимо признать, что в практической деятельности при оценке ПЭК кадаверной роговицы с использованием существующих на сегодняшний день методов ее результаты существенно различаются между собой. Цель — изучить различия в результатах, получаемых при разных методах исследования ПЭК, и разработать объективные критерии и алгоритм оценки донорской роговицы для сквозной пересадки роговицы. Материал и методы. На 100 кадаверных глазах изучены различия в результатах, полученных при разных методах исследования ПЭК (зеркальная и конфокальная микроскопия, кератоанализатор), а также разработаны объективные критерии и алгоритм оценки донорской роговицы для сквозной кератопластики. В качестве контрольного метода выбрана цифровая флюоресцентная микроскопия. Результаты. Для достоверной оценки донорской роговицы может быть использовано среднее значение 3-кратного измерения ПЭК с помощью любого из исследованных в работе методов. Заключение. Наибольшие значения ПЭК определялись при зеркальной микроскопии, наименьшие — при конфокальной. Для достоверной оценки качества донорской роговицы может быть рекомендовано использование среднего значения не менее чем 3-кратного измерения ПЭК с помощью любого из исследованных в работе методов.

Ключевые слова

плотность эндотелиальных клеток
зеркальная микроскопия
конфокальная микроскопия
кератоанализатор
цифровая флюоресцентная микроскопия

Дата публикации: 04.05.2020

По данным ВОЗ, слепота, возникшая вследствие поражения роговицы, занимает 4-е место (5,1%) среди основных причин существенного снижения зрения в мире после катаракты, глаукомы и возрастной макулярной дегенерации. При этом ежегодно в мире проводится более 200 000 операций по трансплантации роговицы [1].

Сквозная кератопластика (СКП) роговицы до сих пор является «золотым стандартом» и наиболее распространенным видом радикальной кератопластики. Вместе с тем в последние годы широкое применение получает задняя послойная (эндотелиальная) кератопластика (ЗПК) при отечных дистрофиях роговицы [2]. Качество и плотность клеток заднего эпителия или эндотелия кадаверной роговицы являются основными характеристиками, определяющими ее пригодность как для сквозной, так и для ЗПК [3].

Наиболее простым и общепринятым способом оценки состояния эндотелия роговицы является ее биомикроскопическая оценка по количеству складок и степени отечности стромы. Однако в современной офтальмологии для более достоверной оценки качества свежей донорской роговицы применяются методы зеркальной [4] и конфокальной [5] микроскопии ее заднего эпителия. При этом известно, что наибольшая сохранность клеток эндотелия возможна при изъятии аутопсийных глаз не более чем через 24 ч после смерти донора.

Сегодня сохранение заднего эпителия роговицы стало возможным благодаря разработке жидких питательных сред для ее среднепродолжительной консервации [6, 7]. Количество эндотелиоцитов донорской роговицы перед СКП, по современным требованиям, должно составлять не менее 2500 на 1 мм² [2,8]. Важен тот факт, что оценить плотность эндотелиальных клеток (ПЭК) возможно и на консервированной роговице при помощи специального прибора — кератоанализатора. Однако необходимо признать, что в практической деятельности при оценке ПЭК кадаверной роговицы с помощью вышеперечисленных методов ее результаты существенно различаются между собой.

В связи с этим нами были поставлены задачи изучения различий в результатах, получаемых при разных методах исследовании ПЭК, и разработки объективных критериев и алгоритма оценки донорской роговицы для СКП и ЗПК.

Материал и методы

На 100 кадаверных глазах после стандартной биомикроскопической оценки роговицы проводили поочередный ее анализ, сначала на эндотелиальном, а затем на конфокальном микроскопах. Для достижения правильной фиксации кадаверного глаза использовали стандартный фиксатор и специальную подставку. Учитывая существенный разброс показателей ПЭК при разных методах исследования, проводилась ее оценка в 7 разных полях центральной зоны роговицы (рис. 1, а,

Рис. 1. Результаты ПЭК, полученные с помощью зеркальной (а) и конфокальной (б) микроскопии.

б). Затем выводили средние значения полученных данных по 3, 5 и 7 полям исследования на каждом приборе.

Далее в стерильных условиях при помощи стандартного набора инструментов выкраивали корнеосклеральный лоскут и помещали в консервирующую жидкую питательную среду.

Спустя 1 ч после консервации проводили анализ ПЭК с помощью кератоанализатора Konan ЕКА-04 (Япония) также в 7 полях (рис. 2, а,

Рис. 2. Оценка ПЭК с помощью кератоанализатора (а) и полученный результат (б).

б). Далее выводили среднее значение показателей кератоанализатора.

На 15 контрольных роговицах после поочередного исследования с помощью зеркального и конфокального микроскопов, а также кератоанализатора, проводили последующий подсчет клеток с помощью световой микроскопии. Последняя была выбрана в качестве контрольного метода, поскольку позволяет визуализировать непосредственно ядра эндотелиоцитов (при помощи люминесцентной окраски), что обеспечивает несравнимо большую точность подсчета ПЭК.

Таким образом, конечным этапом являлась оценка ПЭК уже консервированной роговицы с использованием светового микроскопа. При помощи трепана диаметром 8 или 9 мм выкраивали центральную зону корнеосклерального лоскута. Материал фиксировали в течение 10 мин при комнатной температуре параформальдегидом (4% раствор в фосфатно-солевом буфере). Затем отмывали от фиксатора фосфатно-солевым буфером и красили флуоресцентным красителем DAPI 10 мин при комнатной температуре. Отмывали от DAPI фосфатно-солевым буфером и проводили количественный анализ ядер эндотелиоцитов также в 7 полях с помощью флуоресцентного микроскопа Keyence BZ-9000 (рис. 3, 4,

Рис. 3. Оценка эндотелия с помощью цифрового флуоресцентного микроскопа (а, б).

Рис. 4. Результат ПЭК, полученный с помощью цифрового флуоресцентного микроскопа (а, б).

а, б). После этого, как и в предыдущих случаях, выводили средние значения полученных показателей.

Результаты и обсуждение

При подсчете ПЭК только в одном поле исследования с помощью зеркальной, конфокальной микроскопии и кератоанализатора наблюдается существенный разброс значений — от 1739 до 3274 кл/мм². Результаты приведены в табл. 1, из

Таблица 1. Значения ПЭК кадаверной роговицы при исследовании одного поля

которой видно, что наибольшие показатели ПЭК в большинстве случаев определяются при зеркальной микроскопии, а наименьшие — при конфокальной.

Для анализа результатов исследования ПЭК в нескольких полях (3, 5, 7), кроме средних значений плотности, для каждого метода высчитывали размах выборки, т. е. разницу между максимальным и минимальным значением ПЭК для каждой донорской роговицы.

После этого высчитывали погрешность значений ПЭК, т. е. отличие результатов зеркальной, конфокальной микроскопии и кератоанализатора от данных контрольного метода.

Все результаты подсчетов представлены в табл. 2, 3,

Таблица 2. Сравнительный анализ значений ПЭК кадаверной роговицы при исследовании 3 полей

Таблица 3. Сравнительный анализ значений ПЭК кадаверной роговицы при исследовании 5 полей

4. Обращает на себя внимание тот факт, что для всех использованных приборов погрешность, или разница с контролем, не превышает 10% и является статистически недостоверной. Данное обстоятельство указывает на одинаковую точность средних значений ПЭК, получаемых при исследовании 3, 5 и 7 полей эндотелиальной поверхности.

В табл. 2—4

Таблица 4. Сравнительный анализ значений ПЭК кадаверной роговицы при исследовании 7 полей

обращают на себя внимание незначимые различия погрешностей каждого из методов между собой, что свидетельствует об их сопоставимости и равноценности для подсчета ПЭК кадаверной роговицы.

Таким образом, из полученных результатов следует, что для достоверной оценки донорской роговицы может быть использовано среднее значение 3-кратного измерения ПЭК с помощью любого из исследованных в работе методов.

Выводы

1. При исследовании эндотелия донорских роговиц с помощью зеркальной, конфокальной микроскопии и кератоанализатора разница в значениях однократного измерения ПЭК разными методами составила от 337 до 1243 (наибольшая разница для каждого глаза). Максимальные значения ПЭК определялись при зеркальной микроскопии, минимальные — при конфокальной.

2. При последовательном 3, 5 и 7-кратном измерении ПЭК разными методами погрешности их усредненных значений оказались статистически недостоверными как по сравнению со значениями контрольного измерения с помощью люминесцентного микроскопа, так и при сравнении примененных методов между собой.

3. Для достоверной оценки качества донорской роговицы может быть рекомендовано использование среднего значения не менее чем 3-кратного измерения ПЭК с помощью любого из иследованых методов — зеркальной или конфокальной микроскопии — на свежих донорских роговицах и аналогичного показателя, полученного с помощью кератоанализатора на консервированных лоскутах донорской роговицы.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: В.М., В.Д.

Сбор и обработка материала: Г. О., В.Д., В.Р.

Статистическая обработка: Т.Щ., Х.Х.

Написание текста: Г. О., В.Д.

Редактирование: В.М.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Догузов Владимир Анатольевич—аспирант

e-mail: vladimir.doguzov@gmail.com