Сравнительный анализ информативности исследования палисад фогта методами оптической когерентной томографии и лазерной сканирующей конфокальной микроскопии в норме

Лимбальные палисады Фогта (ЛПФ) были открыты в 1866 г. G. Henle. Но именно A. Vogt в 1921 г. представил подробное описание данной структуры [1]. Несколькими годами позднее G. Aurell и T. Kornerup выдвинули гипотезу, что ЛПФ являются рудиментарными слезными железами. И лишь в 1971 г. M. Davanger и A. Evensen определили роль ЛПФ в процессе регенерации роговичного эпителия [2]. N. Polisetty с соавторами в 1998 г. доказали присутствие лимбальных стволовых клеток (ЛСК) в палисадах Фогта [3].

ЛПФ представляют собой ряд радиально ориентированных к центру роговицы фиброваскулярных трабекул, располагающихся в толще лимба периферичнее каппилярной сети роговицы. Пространство между трабекулами содержит роговичный эпителий на разной стадии дифференцировки, ЛСК, меланоциты, клетки Лангерганса и супрессорные Т-лимфоциты. Трабекулы содержат кровеносные и лимфатические сосуды, а также суббазальные нервные сплетения [4—7].

ЛПФ в большем количестве находятся в верхнем и нижнем секторах роговицы, чем в медиальном и латеральном [4, 5, 8]. Их количество на единицу площади симметричного участка лимба варьирует у разных людей и может изменяться в зависимости от возраста, выполнения хирургических вмешательств и применения лекарственных препаратов [9 — 11].

Работа A. Shortt с соавторами показала, что структуры, традиционно описываемые как лимбальные ниши (ЛПФ), являются лишь частью лимбальной архитектуры. Другая составляющая прогениторных структур представлена фокальными стромальными проекциями (ФСП), располагающимися в апикальной части лимбальных крипт. Оба описанных образования содержат большее количество клеток небольших размеров, экспрессирующих высокие уровни маркеров ЛСК (ABCG2 и p63α), имеющих высокое ядерно-цитоплазматическое соотношение, а также ряд других признаков, позволяющих считать их стволовыми [12]. ЛПФ и ФСП являются ложем ЛСК и играют ведущую роль в поддержании функционирования роговичного эпителия. Они выступают также в роли барьера для эпителиальных клеток конъюнктивы и препятствуют их миграции на поверхность роговицы. ЛСК служат источником клеток с постоянным пролиферативным потенциалом, поддерживающим пул клеток роговичного эпителия. Они обеспечивают устойчивое равновесие между количеством высокодифференцированных тканеспецифичных клеток и сохранением резервуара стволовых клеток [6, 7, 13].

Недостаточность ЛСК и деформация ЛПФ сопряжены с конъюнктивизацией роговицы с последующими дистрофическими корнеальными изменениями, которые приводят к существенному снижению зрения и слепоте. Учитывая отсутствие прямых методик визуализации ЛСК in vivo, изучение ЛПФ позволяет понять общую локализацию и состояние прогениторных клеток.

В настоящее время для обнаружения ЛПФ широко применяют лазерную сканирующую конфокальную микроскопию (ЛСКМ) [9, 10, 14]; в литературе встречаются единичные публикации, посвященные визуализации ЛПФ с помощью оптической когерентной томографии (ОКТ) [15, 16]. Цельюнашей работы стало проведение сравнительного анализа информативности и согласованности результатов исследования палисад Фогта методами ОКТ и ЛСКМ у здоровых лиц.

Обследование прошли 15 здоровых добровольцев (30 глаз) без патологии переднего отрезка глаза, не носивших мягкие контактные линзы и не перенесших интраокулярные оперативные вмешательства в анамнезе. Средний возраст испытуемых составил 38,5±13 лет (от 23 до 56), среди них было 6 мужчин и 9 женщин.

ОКТ лимбальной зоны проводили с помощью оптического когерентного томографа RTVue XR Avanti («Optovue», США, версия программного обеспечения 2016.1.0.26) с насадкой для исследования переднего отрезка глаза по протоколам 3D Cornea и Cornea Cross Line. Размеры зон сканирования по протоколу 3D Cornea составляли 4×4 и 4×6 мм, аксиальная разрешающая способность — 5 μm. Всем пациентам сканирование проводили в верхнем и нижнем лимбальных секторах протяженностью 90°. С целью визуализации ЛПФ в оптимальном качестве использовали режим En Face, включающий стандартную толщину слоя сканирования 30 мкм. С целью поиска прогениторных структур изменяли положение линии сканирования по глубине до получения наиболее четкого изображения. Полученные данные анализировали на предмет наличия ЛПФ, а также оценивали структуру и степень их визуализации. Для определения повторяемости результатов ОКТ лимба всем испытуемым в сроки от 1 до 7 дней было проведено повторное исследование. Протокол Cornea Cross Line использовали для визуализации уровня расположения палисад в верхнем и нижнем лимбе.

ЛСКМ выполняли на Гейдельбергском лазерном ретинальном томографе (LSCM) HRT3 («Heidelberg Engineering», Германия) с роговичным модулем Rostock Cornea Module. Размер получаемых снимков составил 400×400 μm, оптическая разрешающая способность — 4 μm. Оценку палисад Фогта осуществляли в верхнем и нижнем лимбальных секторах в пределах 90°. В начале исследования оператор визуализировал базальный эпителий в центральной зоне роговицы с последующим смещением к верхнему или нижнему лимбу при крайнем отведении взора пациента вдоль вертикального меридиана. Исследование во всех случаях проводилось одним оператором. ЛСКМ использовали в качестве контрольного метода и основного критерия наличия ЛПФ.

Анализ корреляции между методами прямой (ЛСКМ) и непрямой (ОКТ) визуализации ЛПФ осуществляли на основе корреляции по Спирмену. Значения непараметрических признаков были заменены на следующие ранги: 0 — отсутствие палисад; 1 — наличие частично измененных, укороченных палисад; 2 — наличие полноценных палисад.

У всех испытуемых 15 человек (30 глаз) по данным ЛСКМ были обнаружены ЛПФ в нижнем лимбе. Они представляли собой хорошо дифференцируемые высокорефлективные двухконтурные структуры, обычно расположенные в виде параллельных линий или частокола на уровне базального эпителия. Длина и ширина этих структур значительно варьировала, некоторые смежные палисады соединялись друг с другом при помощи перемычек, в других случаях они дихотомически делились на концах (рис. 1, а—в). Чередуясь с лимбальными криптами ближе к их апикальной части располагались фокальные стромальные проекции (ФСП) в виде округлых или овальных образований (см. рис. 1, в, г). У разных пациентов число ФСП значительно менялось — от полного отсутствия до 6—7 проекций в поле зрения. Лимбальные базальные клетки, располагающиеся вдоль лимбальных крипт и ФСП, у лиц со слабой пигментацией кожных покровов были светлее и имели плохо различимые границы, они окружали описанные структуры в виде светлого ореола (см. рис. 1, б, г, з). У лиц с выраженной пигментацией базальные клетки имели гиперрефлективный характер и хорошо визуализировались (см. рис. 1, д), подобные яркие включения встречались также и в межпалисадном пространстве (см. рис. 1, е). Клетки между палисадами характеризовались небольшими размерами, хорошо различимыми светлыми контурами, темной цитоплазмой и отсутствием ядра. Несколько центральнее от апикальных концов лимбальных крипт визуализировались множественные извилистые дорожки или «ручейки», которые прерывали мозаичную картину базального эпителия (см. рис. 1, ж). У одного обследуемого лица в возрасте 30 лет со светлыми кожными покровами на обоих глазах по данным ЛСКМ были обнаружены измененные структуры нижнего лимба: лимбальные крипты носили ячеистый характер, местами они имели вид гиперрефлективных бесструктурных образований, визуализирующиеся трабекулы были укорочены и неравномерны по толщине (см. рис. 1, з).

Зона соединения эпителия конъюнктивы и роговицы у здоровых пациентов характеризовалась негомогенной рефлективностью и значительной вариацией формы и размера клеток. Клетки роговицы имели темную цитоплазму и светлые границы, конъюнктивальные клетки были меньших размеров с плохо дифференцируемыми границами и отличались повышенной рефлективностью (см. рис. 1, и). Наличия бокаловидных и воспалительных клеток на роговичной поверхности не отмечалось.

Структура верхнего лимба, по данным ЛСКМ, значительно варьировала: «классическая» форма палисад в виде частокола была обнаружена в 13 (43%) глазах, в остальных 17 (57%) случаях наблюдались атипичные формы (рис. 2). ЛПФ формировали со стороны склеры ячеистые структуры, переплетающиеся между собой и заканчивающиеся трабекулярными выступами различной длины. Атипичные «неклассические» ЛПФ в верхней гемисфере отличались меньшей структурностью, были более хаотичными и разнообразными по форме. Лимбальные крипты принимали вид циркулярных образований, сот, гиперрефлективных участков; трабекулы были значительно короче и тоньше в сравнении с нижними палисадами. ФСП также встречались в верхней половине роговицы (см. рис. 2).

При анализе данных ОКТ по протоколу 3D Cornea в режиме En Face наилучшая визуализация ЛПФ достигалась при глубине сканирования на уровне боуменовой мембраны или чуть ниже ее. Диапазон залегания лимбальных прогениторных структур значительно варьировал в зависимости от толщины лимбального эпителия. В нижнем лимбе ЛПФ в большинстве случаев (28 глаз) определялись в виде упорядоченных радиально ориентированных к роговице гиперрефлективных продолговатых трабекул (рис. 3—5). В верхнем лимбе встречались различные варианты лимбальных паттернов, чаще всего они представляли собой гиперрефлективные ячеистые структуры, дающие начало продолговатым трабекулам, различным по длине у разных испытуемых (рис. 6). Наряду с подобными паттернами ЛПФ располагались в виде правильного частокола или в виде усеченных, коротких, менее контрастных лимбальных крипт (см. рис. 2).

Уровень локализации ЛПФ хорошо просматривался на вертикальных сканах, выполненных по протоколу Cornea Cross Line. У всех пациентов в верхнем и нижнем лимбе удалось выявить ложе ЛПФ в виде характерного углубления склеры в месте ее корнеосклерального перехода (рис. 7, б). На горизонтальном скане, особенно при исследовании нижнего лимба, визуализировались трабекулы в виде продолговатых гиперрефлективных образований, повторяющих рисунок характерного частокола (см. рис. 7, а).

Проведенные методом ОКТ повторные исследовании лимба у всех испытуемых подтвердили повторяемость ранее полученных результатов (см. рис. 3).

Особенности структуры ЛПФ прослеживались и выявлялись по данным обоих методов исследований (см. рис. 3—6). Анализ изображений лимбальных прогениторных структур по данным ОКТ, выполненных в протоколе 3D Cornea, выявил высокую чувствительность данного метода диагностики. Экстраполяция данных томографии на многопольные снимки ЛСКМ позволила визуализировать в идентичных участках одинаковую структуру и форму ЛПФ, а также расположение ФСП. Оценка согласованности результатов диагностики лимбальных палисад, выполненных методом ЛСКМ и ОКТ, выявила наличие сильной положительной связи (r_S=0,99, p<0,05) в их визуализации как в верхней, так и в нижней гемисферах лимба. Измененное строение ЛПФ в виде усеченных, коротких лимбальных крипт, располагающихся у основания лимбального ложа, деформация палисад в виде бесструктурных гиперрефлективных образований затрудняли их визуализацию методом ОКТ и не позволяли достоверно говорить о наличии лимбальных прогениторных структур лишь в одном из 30 обследованных глаз.

В клинической практике знание о присутствии или отсутствии ЛПФ является важным критерием сохранности ЛСК, обеспечивающих регенерацию и самообновление роговицы. Дисфункция лимбального эпителия, проявляющаяся аномальной конъюнктивально-корнеальной регенерацией, значительно ухудшает зрительный прогноз и качество жизни пациентов. Однако отсутствие палисад не является абсолютным критерием лимбальной недостаточности. Известно, что у 10—20% людей без явной патологии роговицы ЛПФ не визуализируются, в особенности у лиц со слабой пигментацией кожных покровов и пожилых пациентов [5, 9, 10]. В работе D. Patel и соавторов все 16% пациентов с отсутствующими палисадами нижнего лимба были старшей возрастной группой (57 лет и более) [9]. По данным T. Zheng, визуализация нижних ЛПФ была возможна лишь у 40% лиц старше 60 лет [10]. В данном исследовании, как и у других авторов [14], лимбальные прогениторные структуры по данным ЛСКМ были найдены у всех испытуемых, максимальный возраст которых не превысил 56 лет.

Описание лимбальных прогениторных структур в нашей работе не противоречит данным, раннее полученным другими авторами [9, 12, 14], но дает более четкую характеристику особенностям строения лимбальных паттернов в верхней гемисфере роговицы. Согласно градации, предложенной W. Townsend в 1991 г., возможны различные варианты организации ЛПФ: в виде стандартного, усиленного и ослабленного паттернов [5]. В своей работе стандартный «классический» фенотип ЛПФ в виде частокола мы наблюдали в нижнем лимбе, в то время как ослабленные, растянутые в вертикальном меридиане лимбальные трабекулы преимущественно локализовались в верхней гемисфере роговицы, что соответствует данным W. Townsend [5]. Линейная и раздваивающаяся структура ЛПФ роговицы также сопоставима с таковой в клинических наблюдениях [4, 9] и с данными гистологических исследований на кадаверных глазах [17].

В настоящее время в картине ЛСКМ зоны лимба остаются неясными причины формирования так называемых «дорожек» и «ручейков», распространяющихся от апикального конца ЛПФ в сторону центра и прерывающих мозаичную картину базального эпителия. Данные структуры были описаны ранее [9, 14] и, по мнению А. Miri, являются складками базальной мембраны роговицы и подлежащей стромы. Темные участки соответствуют зонам, в которых клетки отсутствуют. Появление подобных темных участков, по мнению авторов [18], вызвано складками соединительной ткани под герминативными клеткам. Измененная топография базальной мембраны и ее неровная поверхность облегчают фиксацию эпителиального пласта и повышают его устойчивость к травмирующим факторам [18]. Кроме того, подобные темные полосы, возможно, являются признаками дистрофии базальной мембраны роговицы [18]. Однако данные ЛСКМ дистрофии базальной мембраны эпителия (map-dot-fingerprint dystrophy), характеризующейся избыточным ростом и складчатостью базальной пластинки, отличаются от вышеупомянутых описаний. Складки аномальной базальной мембраны при данной патологии визуализируются в виде линейных гиперрефлективных структур, внедряющихся в эпителиальный слой роговицы, в отличие от темных гипорефлективных зон с извилистыми контурами, наблюдаемых в норме у здоровых лиц [19]. Проведенный анализ сканов радиально направленных темных «дорожек» (прожилок) выявил наличие в них базальных эпителиальных клеток, контрастирующих с соседними гиперрефлективными клетками, что противоречит данным A. Miri [14]. Характер подобных изменений подробно описал W. Townsend [5]. Он связывает появление темных «ручейков» с центростремительным движением базальных эпителиальных клеток от лимба к центру неповрежденной роговицы. Совокупность темных полосок, идущих от периферии к центру, имитирует картину спиц в колесе, вихря или водоворота. Такая способность базальных клеток лимба к миграции необходима для поддержания пула клеток эпителия роговицы и ее самообнавления.

Проведенный нами анализ литературы не выявил статей, сопоставляющих результаты визуализации ЛПФ методом ЛСКМ и ОКТ (в режиме En Face) in vivo. Существующие работы анализировали изображения ЛПФ, полученные этими методами диагностики на кадаверных глазах [15, 20].

Выявленные преимущества ЛСКМ включали ее высокую разрешающую способность, позволяющую визуализировать структуру палисад на клеточном уровне. Главным недостатком методики стала инвазивность исследования, ограничивающая ее применение у пациентов с заболеваниями роговичной поверхности. В свою очередь ОКТ зоны лимба не требовала контакта с роговицей, обладала также большой разрешающей способностью, высокой скоростью и площадью сканирования до 4×8 мм, легко переносилась испытуемыми. Получаемое при ОКТ изображение позволяло в одном снимке анализировать структуру и плотность расположения ЛПФ в верхней или нижней гемисфере роговицы, визуализировать форму и длину лимбальных крипт. Оценка согласованности результатов диагностики лимбальных палисад, выполненных методом ЛСКМ и ОКТ, выявила наличие сильной положительной связи (r_S=0,99, p<0,05) в визуализации лимбальных прогениторных структур, что подтверждает высокую степень идентичности получаемых изображений.

Таким образом, ОКТ переднего отрезка глаза в протоколе 3D Cornea (режим En Face), обладая высокой информативностью, наглядностью, хорошей повторяемостью и воспроизводимостью результатов, может рассматриваться в качестве альтернативного метода диагностики ЛПФ.

Данные ОКТ позволяют детально визуализировать структуру ЛПФ и в высокой степени коррелируют с результатами ЛСКМ. Учитывая неинвазивный характер обследования, ОКТ может быть рекомендована для определения целостности лимбальных прогениторных структур, прогнозирования течения заболеваний роговицы, ассоциированных с недостаточностью ЛСК, и выбора оптимальной тактики их лечения.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Н.А.П.

Сбор и обработка материала: А.В., Б.Г., А.Ш.

Статистическая обработка данных: А.В.

Написание текста: А.В., Б.Г.

Редактирование: Н.А.П., Н.П.П.

Конфликт интересов отсутствует.