Кирпичников М.П.

Биологический факультет ФГБО ВПО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова», ул. Ленинские горы, 1, стр. 12, Москва, Российская Федерация, 119234; ФГБН «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН, ул. Миклухо-Маклая, 16/10, Москва, Российская Федерация, 117997

Островский М.А.

ФГБУ науки "Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля" РАН, Москва; Объединенный институт ядерных исследований, Дубна

Оптогенетика и протезирование дегенеративной сетчатки

Журнал: Вестник офтальмологии. 2015;131(3): 99-111

Просмотров : 29

Загрузок :

Как цитировать

Кирпичников М. П., Островский М. А. Оптогенетика и протезирование дегенеративной сетчатки. Вестник офтальмологии. 2015;131(3):99-111. https://doi.org/10.17116/oftalma2015131399-111

Авторы:

Кирпичников М.П.

Биологический факультет ФГБО ВПО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова», ул. Ленинские горы, 1, стр. 12, Москва, Российская Федерация, 119234; ФГБН «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН, ул. Миклухо-Маклая, 16/10, Москва, Российская Федерация, 117997

Все авторы (2)

a:2:{s:4:"TEXT";s:112623:"

Дегенеративные заболевания сетчатки глаза, приводящие к потере ее фоторецепторных клеток, являются основной причиной частичной и, в конечном счете, полной слепоты.

Наследственные заболевания (дистрофии) сетчатки поражают 1 из 3000 человек. А самая распространенная форма дегенеративного заболевания сетчатки — возрастная макулярная дегенерация (ВМД) — поражает, согласно Бюллетеню ВОЗ, 1 из 10 человек старше 60 лет.

Что касается ВМД, то в последнее время появились препараты, весьма эффективные в отношении поздней, так называемой «влажной» формы ВМД. Однако сколько-нибудь эффективных препаратов в отношении более ранней, так называемой «сухой» формы в настоящее время не существует, как и способов предотвращения или лечения, например, такой наследственной формы дегенерации сетчатки, как пигментный ретинит.

Суть проблемы сводится к тому, что сейчас нет способов восстановления зрения, если в ходе развития дегенеративного заболевания сетчатка теряет фоторецепторные клетки — палочки и колбочки.

Поэтому насущными задачами являются, с одной стороны, поиски научно обоснованных подходов к профилактике и лечению (поиску сколько-нибудь эффективных лекарственных средств) дегенеративных заболеваний сетчатки глаза, а с другой — поиски эффективных путей протезирования дегенеративной (утратившей фоторецепторные клетки) сетчатки.

Принципиальная возможность протезирования дегенеративной сетчатки основана на том, что потеря фоторецепторных клеток, как правило, не сопровождается потерей следующих за ними нервных клеток сетчатки, во всяком случае, ганглиозных клеток. Отсюда следует целесообразность по крайней мере двух стратегий протезирования дегенеративной сетчатки: технической и биологической.

Под техническим протезированием понимается протезирование с помощью фотоэлектронных чипов; под биологическим, — во-первых, создание или трансплантация новых фоторецепторных клеток, во-вторых, придание сохранившимся («здоровым») нервным клеткам светочувствительности, т. е. превращение их в «псевдофоторецепторные клетки».

Техническое протезирование

В течение по крайней мере двух последних десятилетий были приложены большие усилия и вложены значительные средства в попытки создания светочувствительных имплантов (микроэлектронных фоточипов), позволяющих хотя бы частично восстановить зрение при дегенеративных заболеваниях. Притом что в последнее время появились сообщения о впечатляющих успехах в этой области [1, 2], в целом, в отличие от протезирования слуха, реальное техническое протезирование зрения сколько-нибудь широкого распространения не получило [3].

Целый ряд проблем, в том числе биосовместимость имплантов, остались нерешенными. С помощью фоточипов, как бы миниатюрны они не были и какое бы количество их не содержалось в имплантатах, практически невозможно «задействовать» сколько-нибудь значительное число здоровых ганглиозных клеток и их аксонов из миллиона существующих в сетчатке.

Биологическое протезирование

А. Регенеративное протезирование

Интенсивные попытки создания из стволовых клеток новых фоторецепторных клеток в комбинации с совершенствованием методов тканевой инженерии предпринимаются достаточно давно. Успехи в этом направлении явно просматриваются [4, 5].

Однако следует при этом иметь в виду, что молекулярные механизмы, обеспечивающие строго направленную клеточную дифференцировку соответствующих стволовых (прогенитальных) клеток, в основном остаются невыясненными. Также остаются неясными те требования, которые необходимо удовлетворить для успешной интеграции и сохранения в ткани (в нашем случае в дегенеративной сетчатке, а именно в ее фоторецепторном слое) уже доставленных туда новых клеток.

Совсем недавно в опытах in vitro методами клеточной инженерии удалось получить сетчатку глаза [6]. Речь в данном случае идет об образовании трехмерной ткани сетчатки, содержащей в соответствующих слоях все ее основные типы клеточных элементов, включая фоторецепторы. Важно, что фоторецепторы при этом были способны осуществлять весь процесс фототрансдукции, а от нервных клеток такой сетчатки отводились соответствующие их природе электрические потенциалы. По существу, это первый, впечатляющий шаг на пути к регенерации целой сетчатки.

Б. Оптогенетическое протезирование

В самое последнее время предприняты обнадеживающие попытки биологического протезирования сетчатки с помощью принципиально нового метода. Речь идет об оптогенетике. В оптогенетике свет используется для управления физиологической активностью определенных групп клеток, в первую очередь нейронов в мозгу, а в нашем случае — клеток сетчатки. Этим оптогенетика отличается от получающей распространение генной терапии, задачами которой являются заместить или исправить поврежденный ген или же обойти генетический дефект, восполняя дефицит белка или его нарушенную функцию.

В то же время в отличие от электронного протезирования, задачей которого является электроиндуцированное возбуждение нервных, главным образом ганглиозных, клеток сетчатки извне, при оптогенетическом протезировании клетки сетчатки возбуждаются или тормозятся изнутри. Это физиологическое возбуждение или торможение нервных клеток осуществляется с помощью генетически «имплантированных» в их плазматическую мембрану светочувствительных ионных каналов или иных светочувствительных оптогенетических «инструментов».

Первые и успешные с точки зрения возможности перехода к клиническим испытаниям шаги сделаны в отношении ганглиозных клеток дегенеративной сетчатки мышей (пигментный ретинит), которые удалось превратить в «псевдофоторецепторные» клетки с ON-OFF-рецептивными полями. Конкретно речь идет о работе одной из ведущих в этой области лабораторий в Wayne State University School of Medicine в Детройте, опубликованной в 2013 г. [7].

Остановимся на этой работе чуть подробнее, поскольку она дает представление о современном состоянии проблемы под общим названием «оптогенетика и зрение». В этой работе авторам удалось «имплантировать» в плазматическую мембрану неповрежденных ганглиозных клеток дегенеративной сетчатки два канальных белка, при освещении которых оказалось возможным возбудить или затормозить активность этих клеток и восстановить ON- и OFF-центры их рецептивных полей. Восстановление ON- и OFF-центров рецептивных полей ганглиозных клеток является принципиально важным условием для обработки посылаемой этими клетками в зрительные области мозга информации. Благодаря этому становится возможным восстановить, хотя бы частично, пространственное зрение.

Что касается «имплантированных» в этой работе управляемых светом ионных каналов, то речь идет о семействе ретинальсодержащих белков, так называемых «канальных родопсинах» (channelrhodopsin), способных при действии на них света переносить через плазматическую мембрану катионы или анионы (подробнее см. ниже). Обладателями этих родопсинов являются архебактерии или зеленые водоросли, т. е. это родопсины не животного происхождения. С родопсинами животного происхождения — зрительным пигментом родопсином или меланопсином — их связывает только то, что и те, и другие содержат в качестве хромофорной группы ретиналь и что топография полипептидной белковой цепи в мембране у них одинаковая (полипептидная цепь 7 раз пересекает мембрану). Однако функционально это совершенно разные светочувствительные белки.

Для доставки гена светочувствительного канального родопсина в клетки, в данном случае в ганглиозные клетки дегенеративной сетчатки, используется хорошо известный вектор — рекомбинантный аденоассоциированный вирус. Именно такой вирус разрешен для использования при генной терапии в офтальмологии (см. ниже).

Принципиально важным остается вопрос о белковых мишенях (белковых мотивах), которых должен достичь и на которые должен «сесть» в плазматической мембране ганглиозной клетки аденоассоциированный вирус. В упомянутой выше работе американских авторов удалось идентифицировать два таких белковых мотива, явившихся мишенью для аденоассоциированного вируса, доставившего гены канального родопсина-2 и галородопсина в плазматическую мембрану ганглиозной клетки.

Заслуживает внимания заявление руководителя фирмы «RetroSense Therapeutics», касающееся работ этой лаборатории из Wayne State University School of Medicine в Детройте: «It’s a very hot field, and we are quite pleased to be aligned with Dr. Pan and his colleagues who pioneered the approach». В 2012 г. Foundation Fighting Blindness выделило фирме «RetroSense Therapeutics» $250 000 для доведения в ближайшие 2—4 года работ этой лаборатории до стадии клинических испытаний. Следует также обратить внимание на слова руководителя этой лаборатории доктора Пэна, сказанные им для журнала Retina Today: «We are working to modify the properties of ChR2 and other similar light-sensitive molecules in order to better fit the need for vision restoration». Он не уточнил при этом, о каких именно модификациях канального родопсина (channelrhodopsin-2) может идти речь.

Как нам представляется, помимо «имплантируемых» в плазматическую мембрану ганглиозных клеток ретиналь-содержащих белков, переносящих катионы или анионы и способных, таким образом, деполяризовать (возбудить) или гиперполяризовать (затормозить) физиологическую активность этих клеток и создать их ON-OFF-рецептивные поля, вполне реальным могло бы быть «имплантирование» и других, модифицированных канальных ретиналь-содержащих белков, максимумы секторов поглощения которых находятся в различных областях видимого спектра. В таком случае можно было бы надеяться на хотя бы частичное восстановление цветового зрения. Иными словами, можно было бы превратить ганглиозные клетки дегенеративной сетчатки не просто в «псевдофоторецепторы», а в «псевдоколбочки». При комбинации двух канальных родопсинов, поглощающих свет в зеленой и синей областях спектра, можно было бы восстановить, если не нормальное трихроматическое, то по крайней мере дихроматическое цветовое зрение.

Еще одна заманчивая возможность, вероятно неблизкого будущего, — восстановить в ганглиозных клетках с помощью современных оптогенетических подходов весь ферментативный каскад усиления светового сигнала, наподобие каскада фоторецепции, существующего в фоторецепторных клетках. Речь идет о генетической «имплантации» светочувствительных белков, способных активировать белки-ферменты.

Что касается методов оценки качества восстановленного зрения в эксперименте, а в будущем и в клинике, то возможности для этого имеются (см. ниже).

Таким образом, оптогенетическое протезирование, в первую очередь протезирование ганглиозных клеток дегенеративной сетчатки, может уже в ближайшей перспективе привести к частичному восстановлению зрительного восприятия у полностью слепых пациентов, включая пространственное и даже цветовое зрение.

Стратегии оптогенетического протезирования дегенеративной сетчатки

При выборе стратегии оптогенетического протезирования дегенеративной сетчатки важно учитывать физиологические особенности ее клеточных элементов и принимать во внимание те патологические нарушения, которые в них происходят при той или иной форме заболевания. Важно понимать при этом, что в определенных клеточных элементах дегенеративной сетчатки нарушения могут и не происходить. В первую очередь к таким элементам относятся ганглиозные клетки (см. ниже).

Следует также отдавать себе отчет в том, что успешное оптогенетическое протезирование, выполненное на экспериментальных моделях, еще не означает, что оно в неизменном виде может быть перенесено в офтальмологическую клинику.

Рассмотрим с этой точки зрения физиологические особенности клеточных элементов сетчатки и те изменения, которые в них происходят или могут не происходить при некоторых, наиболее распространенных формах дегенеративных заболеваний.

На рисунке представлены клеточные элементы сетчатки.

Клеточные элементы сетчатки. Средняя ганглиозная клетка содержит мелатонин и посылает аксон в незрительную область мозга, а две крайние ганглиозные клетки посылают свои аксоны непосредственно в зрительную область мозга.

Фоторецепторные клетки

Начнем со светочувствительных фоторецепторных клеток — палочек и колбочек. В ответ на поглощение света они гиперполяризуются. Возникающий в их наружном сегменте медленный гиперполяризационный потенциал распространяется до пресинаптического окончания. Быстрый нервный импульс в палочках и колбочках не возникает.

Биполярные и горизонтальные клетки

За фоторецепторными клетками следуют синаптически связанные с ними нейроны второго порядка — биполярные и горизонтальные клетки. Биполярные клетки, в свою очередь, распадаются на два основных физиологических типа — ON- и OFF-биполяры. ON-биполяры в ответ на свет деполяризуются, OFF-биполяры — гиперполяризуются. В биполярных клетках, как и в фоторецепторах, генерируется только медленная электрическая активность. Нервные импульсы в них также не возникают.

Эти особенности электрических ответов фоторецепторных и синаптически связанных с ними биполярных, а также горизонтальных клеток следует иметь в виду при планировании использования того или иного светочувствительно ионного канала, предполагаемого для генетической «имплантации» в плазматическую мембрану этих клеток.

Амакриновые и ганглиозные клетки

За биполярными и горизонтальными клетками следуют синаптически связанные с ними нейроны третьего порядка — амакриновые и ганглиозные клетки. Синаптический слой (внутренний синаптический слой) между нейронами второго и третьего порядка очень широкий.

Весьма разнородные и многочисленные группы амакриновых клеток осуществляют сложнейшую обработку зрительной информации по горизонтали. Их роль в обработке зрительной информации чрезвычайно велика.

Ганглиозные клетки являются «выходными» нейронами». Они получают сложнейшим образом обработанную во всех предыдущих слоях сетчатки зрительную информацию. В виде нервных импульсов эта информация поступает по аксонам ганглиозных клеток из сетчатки в мозг. При планировании генетической «имплантации» в плазматическую мембрану этих клеток светочувствительных ионных каналов речь должна идти о так называемых «быстрых» ионных каналах.

Ганглиозных клеток и, соответственно, аксонов, образующих зрительный нерв, около 1 млн. Некоторая часть ганглиозных клеток сама обладает светочувствительностью, поскольку содержит светочувствительный ретинальсодержащий пигмент меланопсин. Эти клетки посылают свои аксоны в незрительные (гипоталамические) области мозга. Они отвечают за синхронизацию циркадного ритма, регулирование размера зрачка и выделение мелатонина из эпифиза. Предприняты попытки использовать мелатонин, не являющийся ионным каналом, для оптогенетического протезирования (см. ниже).

Следует подчеркнуть, что ганглиозная клетка сетчатки — это классическая нервная клетка, в которой возникает спайк — быстрая импульсная активность. Именно эти клетки, как представляется на сегодняшний день, являются основными кандидатами на оптогенетическое протезирование дегенеративной сетчатки (подробнее см. ниже).

Рассмотрим клеточные элементы сетчатки с точки зрения целесообразности и реальности их оптогенетического протезирования. Речь при этом пойдет о таких наиболее распространенных дегенеративных заболеваниях, как пигментный ретинит и ВМД. Для удобства рассмотрения условно выделим три стадии дегенеративного процесса: сначала нарушения в фоторецепторных клетках, затем дегенерация этих клеток и, наконец, нарушения в нейральной части сетчатки — ниже расположенных нервных слоях, включая как ее нервные, так и глиальные клетки [8—10].

Фоторецепторные клетки и клетки ретинального пигментного эпителия

При пигментном ретините фоторецепторные клетки гибнут, причем палочки раньше колбочек [11]. Жизнеспособность колбочек может сохраняться достаточно долго. Однако, в конечном счете, колбочки гибнут тоже. При некоторых других формах дегенерации ситуация может быть обратной: колбочки повреждаются раньше палочек. Практически одновременно с потерей палочек и колбочек происходит миграция и потеря клеток ретинального пигментного эпителия.

Исходя из того, что при некоторых формах дегенеративных заболеваний колбочки остаются на какое-то время жизнеспособными, одна из стратегий оптогенетического протезирования состоит в протезировании колбочек. При этом «имплантировать» в плазматическую мембрану колбочек следует «медленные» светочувствительные гиперполяризующие ионные каналы. В качестве такого канала был успешно использован бактериальный хлорпереносящий галородопсин [12].

Если бы удалось протезировать колбочки, то в принципе можно было бы восстановить физиологическую активность самого первого, фоторецепторного звена в нервной сети сетчатки. Следствием такого успеха стало бы восстановление механизма естественной обработки зрительной информации всеми нижележащими нервными слоями сетчатки, т. е. всей ее нервной сетью. В таком случае качество восстановленного зрительного восприятия, конечно, могло бы быть наилучшим. К сожалению, столь заманчивая стратегия протезирования колбочек представляется не слишком реальной, поскольку длительная жизнеспособность колбочек дегенеративной сетчатки маловероятна. Поэтому, при всем желании, колбочки не могут рассматриваться как наилучший объект для оптогенетического протезирования.

В ходе дегенеративного процесса вслед за потерей фоторецепторов наступают нарушения и во внутренних слоях сетчатки, включая ее нервные и глиальные клетки.

Биполярные клетки

Самые ранние признаки повреждения в нейральных слоях сетчатки наблюдаются в тех биполярных клетках, которые синаптически связаны с палочками, но не с колбочками [13]. Среди целого ряда молекулярных и цитологических нарушений биполярных клеток следует указать на возможность изменения их полярности, т. е. на превращение ON-биполяров в OFF-биполяры [14]. Это одно из принципиально важных ограничений их оптогенетического протезировании. Другое, в настоящее время методическое ограничение состоит в том, что специфический промотор найден пока только для ON-, но не для OFF-биполяров [15]. Вместе с тем ON-биполяры сравнительно недавно были успешно протезированы с помощью «имплантации» в их плазматическую мембрану деполяризующего канала — канального родопсина-2 [16].

В целом, однако, складывается впечатление, что биполярные клетки, как и фоторецепторы, не являются достаточно надежным объектом для оптогенетического протезирования. Хотя в случае успеха также можно было бы сохранить значительный объем естественной обработки зрительной информации и достичь вполне приемлемого восстановления зрительных функций.

Ганглиозные и амакриновые клетки

Для оптогенетического протезирования принципиально важно, что ганглиозные и амакриновые клетки наиболее устойчивы при развитии дегенеративного процесса. Они сохраняются неповрежденными даже на поздних стадиях заболевания [17]. Крайне важно также, что они сохраняют не только свои нормальные физиологические свойства, но и свое местоположение в сетчатке по отношению к внутренней пограничной мембране [18].

Таким образом, ганглиозная клетка как классическая нервная клетка с импульсной активностью и наиболее устойчивая при развитии дегенеративного процесса может рассматриваться как наиболее реальный кандидат для оптогенетического протезирования дегенеративной сетчатки [7, 19, 20].

Непреодолимым недостатком при таком протезировании становится потеря механизма сложной и естественной для здоровой сетчатки обработки информации во всех ее вышележащих слоях. Поэтому для восстановления приемлемого зрительного восприятия потребуются специальные усилия, направленные на формирование достаточно адекватной зрительной информации, посылаемой сохранившимися ганглиозными клеткам в зрительные и незрительные области мозга.

Под «специальными усилиями» понимается создание таких искусственных способов создания и обработки информации, посылаемой ганглиозными клетками в мозг, которые позволили бы кодировать яркость и контраст изображения, воссоздать механизм адаптации к соответствующему уровню освещенности, восстановить пространственное зрение, цветовосприятие и многие другие физиологические свойства зрительной системы. Восстановление с помощью оптогенетического протезирования ганглиозных клеток хотя бы приемлемого зрительного восприятия стало бы большим успехом.

Следует отметить, что необыкновенная пластичность мозга позволяет надеяться на его способность к вполне приемлемой обработке даже такого рода несовершенной зрительной информации. Одним из наглядных примеров тому может служить способность зрительной системы человека со временем адаптироваться к той неестественной информации, которую она получает от имплантированных в дегенеративную сетчатку фотоэлектронных устройств [1, 2, 21].

Другим, ярким примером исключительной пластичности мозга может служить создание у обезьян-дихроматов с помощью методов современной генной терапии трихроматического зрения. Мозг обезьян достаточно быстро и эффективно адаптировался к такому новому для него «человеческому» зрению [22].

Важные соображения в отношении неизбежных сложностей, возникающих при оптогенетическом протезировании ганглиозных клеток, преодоление которых необходимо для достижения удовлетворительного зрительного восприятия, были высказаны на первой международной конференции, посвященной оптогенетическому протезированию зрения, Франком Верблиным — известным специалистом в области обработки зрительной информации [23]. Во-первых, по его мнению, потребуется создание системы, имитирующей обработку информации на всех уровнях сетчатки — от фоторецепторов до ганглиозных клеток, включая кодирование яркости, контраста изображения, насыщения и адаптации (http://mcb.berkeley.edu/labs/werblin/).

Весьма перспективными в этой связи становятся работы по созданию систем кодирования светового сигнала с тем, чтобы оптогенетически протезированные ганглиозные клетки получали информацию в «привычном» для них виде [24]. Многообещающим также является возможность голографической стимуляции протезированной сетчатки [25].

Во-вторых, основываясь на опыте слухового и зрительного протезирования, Ф. Верблин еще раз подчеркнул, что поразительные пластические возможности зрительной коры головного мозга, по всей видимости, смогут решить проблемы, возникающие при поступлении в мозг зрительной информации, отличной от естественной.

Стратегии использования существующих и создания новых светочувствительных «инструментов» для оптогенетического протезирования дегенеративной сетчатки

В современной оптогенетике основными светочувствительными «инструментами» являются ретиналь-содержащие мембранные белки — катионные или анионные ионные каналы и насосы. Совершенно очевидно, что для прогресса во многих областях современной оптогенетики, в том числе в области оптогенетического протезирования дегенеративной сетчатки, необходим поиск новых светоактивируемых белков с различными функциональными свойствами. Речь может идти как о совершенствовании канальных или иных ионпереносящих белках, так и о белках-рецепторах, активность которых может быть селективно включена или выключена при действии света с определенной длиной волны. Возможность «имплантации» в плазматическую мембрану ганглиозной клетки дегенеративной сетчатки двух канальных белков, способных де- и гиперполяризовать мембрану, в ближайшем будущем может стать реальной основой для протезирования дегенеративной сетчатки (см. выше). «Имплантация» же в эту мембрану светорегулируемого белка-рецептора наподобие опсина — G-белоксвязывающего рецептора зрительного пигмента родопсина, а также биоинженерное конструирование в ганглиозной клетке всего ферментативного каскада фототрансдукции, включающего механизмы его «включения» и «выключения», представляется хотя и реальной задачей, но задачей, вероятно, на неблизкую перспективу.

Иными словами, превращение ганглиозной клетки дегенеративной сетчатки не в «псевдофоторецептор», как это уже стало реальным сейчас в опытах на экспериментальных животных, а в близкое подобие настоящей зрительной клетки — палочки или колбочки, обладающей и ферментативным каскадом усиления светового сигнала, и механизмами световой и темновой адаптации, позволило бы наиболее качественно восстановить зрительное восприятие.

Что касается «оптогенетики для зрения», то следует подчеркнуть, что во многих отношениях она существенно отличается от «оптогенетики для мозга». Во-первых, существенно различаются по спектральной характеристике и интенсивности параметры светового стимула. Если, например, для возбуждения или торможения импульсной активности нейронов мозга интенсивность светового стимула не является принципиальной, то слишком яркий стимул для сетчатки недопустим, поскольку способен вызвать фотоповреждение ее клеточных элементов. Во-вторых, физиологические свойства разнородных клеток сетчатки отличны от свойств нейронов мозга. В большинстве клеток сетчатки, как было сказано выше, — в фоторецепторных, биполярных и горизонтальных — генерируется лишь медленная электрическая активность и лишь в ганглиозных клетках возникают спайки, т. е. быстрая импульсная активность, подобная нейронам мозга. В-третьих, в отличие мозга, световая стимуляция нейронов которого требует специальных технических ухищрений, глаз обладает естественной оптической системой и световая стимуляция клеток сетчатки не представляет трудностей. В этом одно из больших преимуществ «оптогенетики для зрения». Вместе с тем одним из пока непреодоленных препятствий является отсутствие способов восстановления механизмов принципиально важных физиологических свойств зрительной системы, в первую очередь механизмов световой и темновой адаптации. Ведь именно благодаря многокомпонентному механизму адаптации зрительная система способна функционировать в широчайшем диапазоне освещенностей — до 10—12 логарифмических единиц. Диапазон же освещенностей, который позволяет на сегодняшний день перекрыть оптогенетическое протезирование, не превышает 2—3 логарифмических единиц [16].

Иными словами, принципиальным отличием нормального зрения от оптогенетически протезированного становятся не столько функциональные свойства/характеристики светочувствительных «инструментов», в первую очередь ионных каналов и насосов (эти свойства/характеристики в настоящее время стремительно улучшаются), сколько отсутствие способов восстановления внутриклеточной «машинерии», обеспечивающей биохимическое усиление входящего светового сигнала и адаптацию протезированных клеток к фоновой освещенности.

Семейство фотоактивируемых ретинальных мембранных белков — родопсинов

Трудно сказать, удивительно это или закономерно, но открытие в 1876 г. зрительного пигмента родопсина и его подробнейшее изучение как светочувствительного ретиналь-содержащего белка и одновременно как G-белоксвязывающего рецептора [26], а затем открытие в начале 70-х годов прошлого века бактериородопсина [27] привело, в конечном счете, к созданию всего несколько лет назад «инструментов» оптогенетики — родопсинов микробиального происхождения. Конечно, зрительные родопсины животного происхождения и микробиальные родопсины — это разные белки с совершенно разными функциями, хотя и предполагается, что микробиальные родопсины и родопсины многоклеточных (беспозвоночных и позвоночных животных) гомологичны и что первые являются предшественниками вторых [28]. Как бы то ни было, и те, и другие — это мембранные белки, топография которых в мембране принципиально одинакова, хромофор которых — ретиналь также одинаков, но только находится в различных изомерных конфигурациях. Одна и та же фотохимическая реакция — фотоизомеризации ретиналя «запускает» конформационные перестройки белковой части этих молекул, тем самым активируя их функции — инициацию фототрансдукции в случае зрения или пассивный или активный перенос ионов в случае фототаксиса или бактериального фотосинтеза.

Три класса родопсинов бактерий и зеленых водорослей находят в настоящее время применение в оптогенетике. Это класс ионных каналов, а именно светоуправляемый канальный родопсин (channelrhodopsin — ChR) из зеленой водоросли Chlamydomonas (и его мутанты — биоинженерные модификации), и два класса ионных насосов — хлорпереносящий галородопсин из бактерии Natronomas faraonis (NphR) (и его мутанты) и бактериородопсин, а именно фотоактивируемый протонный насос археародопсин-3 (Arch3) Halorubrum sodomense.

Что касается канального родопсина, то наибольшее распространение, в том числе в оптогенетике зрения, получил катионный канальный родопсин-2 (channelrhodopsin-2 — ChR2) из зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardii. Будучи экспрессирован в нервной клетке и встроен в ее плазматическую мембрану, канальный родопсин-2 при действии синего (470 нм) света быстро (в пределах 50 мс) деполяризует ее. Одним из важных его недостатков остается неселективность. Попытки модифицировать его в селективный катионный канал — натриевый, калиевый или кальциевый — пока не увенчались успехом. Вместе с тем для оптогенетики в целом и для оптогенетики мозга и сетчатки в частности это представляется крайне важным. Например, создание кальций-селективного ионного канала позволило бы подробно исследовать и управлять внутриклеточной передачей сигнала, в которой кальций важнейший внутриклеточный посредник, синаптической передачей, в которой кальций играет ключевую роль, и многими другими важнейшими физиологическими функциями.

Следует отметить, что канальный родопсин стал последним из бактериальных родопсинов, который был описан, и первым, который нашел применение в оптогенетике. В настоящее время он используется более чем в тысячи лабораторий [29]. Первым же из открытых и подробно изученных, начиная с конца 60-х — начала 70-х годов, был протонпереносящий бактериородопсин архебактерий Halobacterium. Затем в этих же бактериях были открыты сенсорные родопсины, ответственные за их фототаксис, и хлорпереносящий галородопсин, работающий в паре с бактериородопсином.

При одновременной экспрессии в нервной клетке деполяризующего ее плазматическую мембрану канального родопсина-2 (ChR2), поглощающего синий свет, и гиперполяризующего мембрану галородопсина (NphR), поглощающего желтый свет, появляется возможность, чередуя синие и желтые вспышки света, возбуждать и тормозить нервную клетку, т. е. управлять ее физиологической активностью. Именно такой подход был применен для создания ON-OFF-рецептивных полей ганглиозной клетки дегенеративной сетчатки [7].

Благодаря успехам современной биоинженерии, семейство канальных родопсинов стремительно расширяется. Остановимся подробнее на нескольких наиболее важных, по нашему мнению, работ последнего времени.

Если природный канальный родопсин поглощает свет в фиолетово-синей области спектра, то современная оптогенетика и для мозга, и для сетчатки требует светоуправляемых ионных каналов, поглощающих во всем диапазоне видимого спектра. Если для нейрофизиологических исследований мозга особенно важно располагать каналами, поглощающими в далекой красной области спектра, то для оптогенетического протезирования сетчатки желательно иметь каналы, поглощающие, подобно зрительным пигментам палочек и колбочек человека, во всем диапазоне видимого спектра, включая его синюю, зеленую и красную области.

В последнее время попытки спектральной настройки канального родопсина увенчались успехом. Так, например, была получена биоинженерная конструкция, состоящая из химеры канального родопсина-1 хламидомонады (Chlamydomonas) и канального родопсина-1 вольвокс (Volvox), поглощающая свет в области от 526 до 545 нм, и канального родопсина-2 хламидомонады, поглощающего в области от 461 до 492 нм [30]. Такая сложная конструкция, если бы ее удалось применить при оптогенетическом протезировании дегенеративной сетчатки, позволила бы возбудить две или даже три различных популяции ганглиозных клеток соответственно красным, синим и зеленым светом, превращая их в набор «псевдоколбочек» для трихроматического зрения.

Недавно создан новый красно-активируемый вариант канального родопсина (red-activatable ChR — ReaChR), который возбуждается оранжево-красным светом (λ ~590—630 нм). Этот родопсин, в отличие от существующих красночувствительных канальных родопсинов, намного лучше встраивается в плазматическую мембрану нервной клетки и генерирует существенно большие фототоки с более быстрой кинетикой [31]. Самым же важным для исследования мозга и вполне вероятного клинического применения является то, что такой деполяризующий мембрану канальный родопсин позволяет возбуждать нейроны инфракрасным светом через интактный череп. Это означает, что отпадает необходимость создания в черепе хирургического «окна» и имплантации в мозг оптического волокна.

Совсем недавно появилась принципиально важная работа, в которой сообщается о качественном изменении канального родопсина. Впервые удалось создать канальный родопсин, способный переносить не катионы, а анионы [32]. Существующие в настоящее время катионпереносящие канальные родопсины способны деполяризовать плазматическую мембрану. Они широко используются в оптогенетике для возбуждения нервных клеток и мозга, и сетчатки. Для торможения же, как правило, использовался другой светоуправляемый, анионпереносящий канал, например хлорпереносящий галородопсин. Созданный же авторами с помощью методов современной биоинженерии вариант анионпереносящего канального родопсина, у которого в области селективного фильтра отрицательно заряженный аминокислотный остаток был заменен на положительный, способен при действии света гиперполяризовать плазматическую мембрану. Это означает, что он с успехом может быть использован для торможения физиологической активности нервной клетки. По сущес

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail