Стратегия экспериментального изучения возможностей и эффективности современных способов лечения заболеваний сетчатки направлена на тщательный выбор экспериментальной модели заболевания и анализ ее адекватности поставленным задачам исследования.
Моделирование патологических процессов и различных заболеваний является важнейшим инструментом исследователей, позволяющим выявлять их патогенетическую структуру и механизмы формирования.
Данная часть обзора посвящена моделям, при которых у животных воссоздание патологических процессов происходило в результате химического, биологического или физического воздействия. Эти индуцированные модели созданы на различных животных, они ориентированы на гистологическую приближенность к существующим в природе дегенеративно-дистрофическим заболеваниям сетчатки человека, в том числе и вторичным. К вторичным дистрофиям сетчатки, часто наблюдающимся при системных заболеваниях, относятся дистрофии, обусловленные сосудистыми нарушениями, которые связаны с циркуляторными расстройствами в системе центральной артерии и центральной вены сетчатки.
Химически индуцированные модели получают путем токсического поражения сетчатки при инъекции химических соединений внутривенно, субретинально или в полость стекловидного тела глаза животных.
Т. Kuwabara и соавт. в 1981 г. для развития атрофии ретинального пигментного эпителия (РПЭ) вводили гидрохлорид L-орнитин интравитреально приматам и крысам линий Sprague-Dawley и Long-Evans [24]. В ответ на введение препарата развивался отек РПЭ, нарастающий в течение 4 ч после инъекции и нивелирующийся к 24 ч. После этого развивалась атрофия РПЭ разной степени выраженности. К указанным изменениям позднее присоединялась дистрофия фоторецепторов.
В модели G. Korte и соавт. исследователи использовали системное внутривенное введение экспериментальным животным раствора натрия йодата (NaIO3), селективно разрушающего РПЭ [22]. В качестве экспериментальных животных служили кролики New Zealand. После инъекции указанного раствора у животных к 14-му дню развивалась ретинопатия с частичной атрофией РПЭ.
В 1986 г. G. Korte и соавт. использовали ту же модель на крысах [21]. Натрий-йодатной моделью для изучения возрастной макулярной дистрофии (ВМД) человека пользуются до сих пор. В частности, Y. Shen и соавт. использовали эту модель для разработки ВМД на 8-недельных самцах крыс линии Brown-Norway в 2011 г. [31]. Некоторые исследователи одним из недостатков модели Korte считают возможность самопроизвольной реставрации хориоретинального комплекса примерно к 21-му дню вообще без лечения, что может затруднить использование указанной модели для оценки эффективности клеточной трансплантации в качестве терапевтической технологии.
В 1993 г. В.Х. Хавинсон и соавт. для изучения поражений сетчатки, наблюдаемых при вторичных хориоретинальных дистрофиях, предложили модели токсической дистрофии сетчатки у половозрелых кроликов шиншилла путем внутривенного введения 4% раствора монойодуксусной кислоты или 3% раствора йодистого калия [11].
В 2003 г. G. Chidlow и N. Osborne описали другую модель токсического поражения сетчатой оболочки — каинатную ретинопатию у крыс [17]. Исследователи вводили животным каиновую кислоту интравитреально. Каиновая кислота, структурный аналог глутамата, является прямым агонистом ионотропного глутаматного рецептора, а именно каинатного. Введение каиновой кислоты in situ приводит к избыточному накоплению внеклеточного глутамата, который в больших дозах дает нейротоксический эффект. Внеклеточный глутамат блокирует синаптическую передачу между фоторецепторами и биполярными клетками, вызывая гибель последних. В 2004 г. каинатная ретинопатия была воспроизведена на кроликах Н.В. Пак и соавт. [7]. Электрофизиологическим исследованием авторы показали, что каинатная ретинопатия сетчатки кроликов проявляется гибелью биполярных и мюллеровских клеток. В 2011 г. R. Mali и соавт. каинатную ретинопатию воспроизвели на мышах CD-1 [27]. По результатам исследований у мышей происходила гибель ганглиозных и амакриновых клеток.
Кроме инъекций каиновой кислоты, для токсического повреждения сетчатки у крыс и мышей используют интравитреальные инъекции N-метил-D-аспартата, селективного агониста NMDA-рецептора, относящегося, так же как и каинатный рецептор, к группе ионотропных глутаматных рецепторов [17, 27].
В 2011 г. М. Kuro и соавт. для изучения пигментного ретинита у человека использовали системное внутривенное введение мышам канцерогенного агента N-метил-N-нитрозомочевины, приводящего к гибели фоторецепторов сетчатки [23].
Для изучения ВМД может быть использована модель хориоидальной неоваскуляризации (CNV) сетчатки, поскольку развитие субретинальной неоваскулярной мембраны характерно для этого вида дистрофии. Так, L. Tee и соавт. [32] в 2008 г. получали CNV сетчатки и зрительного нерва у кроликов путем интравитреального введения фактора роста эндотелия сосудов (VEGF).
Кроме использования VEGF модель CNV сетчатки может быть получена при введении гидроперекиси линолевой кислоты — HpODE (13(S)-hydroperoxy-9Z,11E-octadecadienoic acid). Известно, что HpODE обнаруживается у человека субмакулярно в мембране Бруха при старении. HpODE была использована Т. Baba и соавт. в 2010 г. при разработке модели CNV на крысах линии Sprague-Dawley [15]. Исследователи вводили HpODE субретинально. Более ранняя модель CNV с использованием HpODE была разработана на кроликах.
V. Lyzogubov и соавт. в 2011 г. описали использование субретинальной инъекции полиэтиленгликоля мышам линии C57BL/6, позволившее получить ускоренную модель CNV, которая может быть полезной при изучении влажной ВМД [26].
Биологически индуцированные модели получают путем активирования патогенетических механизмов в сетчатке, приводящих к патологическим изменениям, при инъекциях биологических субстратов, в том числе клеточных элементов, в полость стекловидного тела животным. Такое экспериментальное моделирование широко используется для изучения механизмов становления и развития пролиферативной витреоретинопатии (ПВР). В настоящее время описаны модели ПВР после введения в стекловидное тело культуры клеток дермальных фибробластов [19], мононуклеаров крови [3], тромбоцитов [13], активированных макрофагов [20], клеток из культуры РПЭ [12]. Основная задача подобных экспериментов — не только моделирование патологического процесса у животных, относительно сходного с тем, который наблюдается у человека, но и исследование его в динамике. Главным критерием во всех моделях является формирование тракционной отслойки сетчатки и пролиферативной ткани в полости глазного яблока у экспериментальных животных.
Однако выявление ПВР при моделировании с дермальными фибробластами не соответствует патогенетическим особенностям данного процесса. Кроме того, в большинстве моделей ПВР в качестве ведущего патогенетического фактора используются клетки, изначально играющие важную роль в процессах пролиферации (фибробласты, активированные макрофаги).
Физически индуцированные модели получают в результате механического и светового повреждения сетчатки.
S. Fisher и соавт. показали, что при нанесении механической травмы у кроликов происходит отслойка сетчатки и имплантация в субретинальное пространство обломков РПЭ, формируется модель атрофии хориокапилляров и РПЭ [18].
Световые повреждения сетчатки. Органические повреждения тканей глазного дна неионизирующими электромагнитными излучениями оптического диапазона могут возникнуть как под влиянием прямого и отраженного солнечного света, так и в результате воздействия созданных человеком светотехнических устройств.
Повреждение сетчатки видимым, некогерентным светом. В настоящее время к видимому излучению оптического диапазона относится излучение с длинами волн от 400 до 780 нм [8].
Термический механизм повреждения органа зрения световым излучением является наиболее универсальным для видимой части спектра при длительности воздействия от 1 мс до 10 с. Значительная часть энергии излучения этого диапазона, поглощаясь оболочками глаза, превращается в тепло и нагревает ткань. При достаточно высокой плотности мощности излучения выделяющееся в очаге облучения тепло вызывает коагуляцию белков и других органических материалов, что клинически выявляется в виде ожога ткани.
В 1966 г. W. Noell и соавт. показали в эксперименте на крысах, что повреждение сетчатки может иметь место при длительном воздействии света умеренной интенсивности, недостаточной для образования термического ожога [28]. В настоящее время известно, что такого рода повреждения возникают за счет воздействия видимого излучения голубой части спектра (400—500 нм), оказывающей на сетчатку специфическое фотохимическое действие [8]. Это дало основание назвать такие повреждения — повреждениями голубым светом. В 2010 г. А. Wielgus и соавт. использовали голубую коротковолновую часть видимого света для развития ВМД у крыс линии Sprague Dawley [33].
Повреждающее действие света различной интенсивности на компоненты гематоретинального барьера и нейросенсорные клетки показано во многих работах. Так, в работах R. Willams и соавт. [34] и S. Rowland и W. Dawson [29] пороговые альтеративные изменения нейросенсорных клеток сетчатки или РПЭ у крыс возникали при воздействии света интенсивностью в 65—130 лк. В настоящее время нет единого мнения о том, что поражается светом в первую очередь — нейросенсорные клетки сетчатки или РПЭ. По одним данным, первоначальные деструктивные процессы затрагивают РПЭ и лишь затем нейросенсорные клетки. Другие исследователи наблюдали первые изменения в нейросенсорных клетках, варьирующие от дозы облучения.
В экспериментах на беспородных белых крысах воздействие света высокой интенсивности вызывало деструктивные изменения всех элементов сетчатки глаза. Наблюдались также гемодинамические расстройства, ультраструктурные нарушения эндотелиоцитов, базальной мембраны капилляров, что приводило к нарушению целостности гематоретинального барьера [6]. В одной из последних работ этой серии исследовалось воздействие в течение суток яркого постоянного света в 1000 лк на сетчатку крыс линии Sprague Dawley. Была продемонстрирована гибель фоторецепторов с последующей дегенерацией сетчатки [30]. Таким образом, степень повреждения видимым светом зависит от таких факторов, как интенсивность освещения, время экспозиции, спектральные характеристики источника света, возраст и реактивность облучаемого организма.
Воздействия на сетчатку когерентного света. Лазеры, изобретенные в 1955 г., стали принципиально новым источником излучений оптического диапазона, способных вызвать повреждение сетчатки за значительно более короткий промежуток времени, чем тот, который необходим для срабатывания физиологических защитных механизмов.
Путем лазерного воздействия на сетчатку глаза экспериментальных животных получают модели острой ишемии сетчатки, CNV и модель очагового поражения сетчатки. Для этого используют различные типы лазеров: аргоновый, гелий-неоновый, неодимовый алюмоиттриевый гранат (Nd:YAG) и другие (ксеноновый, лазер на красителях, диодный лазер), — излучающих в УФ-видимой или ИК-области спектра.
Степень повреждения лазером зависит от таких факторов, как длительность импульса, мощность или энергия излучения, а также время воздействия.
Для создания модели CNV ВМД используют излучение мощностью 150—300 мВт, длительность экспозиции 0,1—0,2 с, диаметр пятна до 100 мкм [1, 16, 31].
Модель очаговой патологии сетчатки получают лазерным повреждением сетчатки в нижнем квадранте глазного дна [5, 7, 9, 14]. Для этого на расстоянии одного диаметра диска зрительного нерва от зрительного нерва наносят 20 сливных коагулятов, мощность излучения составляет 300—400 мВт, длительность экспозиции 0,1 с, диаметр пятна до 300 мкм (ожог III степени по F. L’Esperance [25]).
Для создания модели острой ишемии сетчатки производят лазеркоагуляцию ретинальных сосудов I—III порядка в наружном квадранте глазного дна [4, 5, 9, 14].
В зависимости от диаметра коагулируемого сосуда мощность импульса варьируется от 500 до 1000 мВт, диаметр пятна — от 200 до 500 мкм, время экспозиции — в пределах 0,1—0,5 с (см. таблицу).
Как видно из таблицы, мощность лазера при длительности экспозиции 0,1 с определяет вид получаемой модели. Так, наименьшая мощность требуется для создания модели CNV (150—300 мВт), а наибольшая — для получения модели острой ишемии (500—1000 мВт).
При создании экспериментальной модели острой ишемии сетчатки, связанной с нарушением ретинального кровотока в результате окклюзии ретинальных сосудов, используют также метод фотодинамической терапии (ФДТ). Основным преимуществом ФДТ в сравнении с другими энергетическими методами является целенаправленное воздействие в основном на сосудистую систему, а именно на эндотелиальные клетки капиллярной сети.
В 1991 г. С. Wilson и D. Hatchell [35] предложили для создания фотохимического тромбоза ретинальных сосудов внутривенно вводить фотосенсибилизатор и световым излучением, источником которого является щелевая лампа, облучать сосуды сетчатки. Полная световая энергия для получения окклюзии ретинальных сосудов составила 0,06—0,50 Дж в зависимости от концентрации фотосенсибилизатора (20—80 мг/кг). Продолжительность окклюзии зависела от длины обработанного сосуда и его типа. И если для проведения ФДТ в данной работе был использован ламповый источник света, то уже в начале нынешнего века начали применять воздействие лазерным излучением [1]. Целенаправленное воздействие в основном на эндотелиальные клетки капиллярной сети обеспечивается несколькими компонентами: наличием фотохимического агента (фотосенсибилизатора), избирательно накапливающегося в тканях, взаимодействующего с ним лазерного излучения с длиной волны, соответствующей пику поглощения конкретного фотосенсибилизатора, и кислорода, содержащегося в ткани. При фотодинамических повреждениях разрушаются в основном мембраны митохондрий, прекращается синтез АТФ, синтез и транспорт ДНК. Повреждение митохондрий также ведет к индуцированной конденсации ядерного хроматина, что вызывает апоптоз клетки. Параллельно с этим происходит фотоповреждение до 80% клеточных лизосом [10]. Более подробно механизм ФДТ рассмотрен в обзоре [2].
На сегодняшний день синтезировано несколько сотен химических соединений, способных выступать в роли фотосенсибилизатора, их объединяют по типу химических соединений и способу получения, а также по спектральным характеристикам максимумов поглощения.
Таким образом, как видно из обзора, разработано большое количество подходов для экспериментального моделирования на животных дегенеративно-дистрофических заболеваний сетчатки человека, знание о существовании которых позволяет исследователю подобрать для решения своей задачи наиболее адекватную.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (проект 16.512.11.2158).