Среди факторов хозяина, определяющих естественное течение хронической инфекции, вызванной вирусом гепатита С (HCV), и ее исход, наряду с классическими (клинико-демографическими) в последнее время широко изучаются генетические факторы, определяющие индивидуальные особенности течения заболевания и ответ на лечение. Выявлены различия по скорости развития фиброза при наличии однонуклеотидных замен в последовательности генов, приводящих к изменению активности или концентрации продукта генов цитокинов, гемохроматоза, локальной тканевой ренин-ангиотензин-альдостероновой системы, дисфункции эндотелия [1, 2].

Предполагается, что гиперкоагуляция также играет важную роль в процессах фиброза в печени. Возникая при воспалении, она приводит к отложению фибрина и развитию внутрипеченочных микротромбов в микрососудистом русле печени с последующей активацией звездчатых клеток тромбином, что может послужить дополнительным фактором, ускоряющим процессы фиброза [3]. Повышенное отложение фибрина продемонстрировано на модели фиброза печени [4]. В ходе другого исследования показано, что у линии мышей, несущих мутацию гена фактора V, после хронического воздействия четыреххлористого углерода фиброз печени более выражен, чем у мышей дикого типа [5]. Резвившаяся ишемия вследствие образования микротромбов вызывает активацию эндотелиального фактора роста, индуцирующего неоангиогенез [6].

Совокупность этих факторов приводит к нарушению синусоидального потока, что в свою очередь усугубляет ишемию, ускоряет апоптоз и приводит к коллапсу в области между центральной веной и портальным трактом [7].

Цель исследования: оценить клиническую и прогностическую значимость носительства различных аллельных вариантов генов системы свертывания и тромбоцитарных рецепторов (FII 20210 G/A, FV 1691G/A, FVII 10976 G/A, FXIII 103 G/T, FBG -455 G/APAI-1 675 5G/4G, MTHFR 677 C/T, ITGB3 1565 T/C, ITGA2 807 C/T) в прогрессировании фиброза печени у больных хроническим гепатитом С (ХГС).

В исследование включили 188 больных ХГС и циррозом печени (ЦП) в его исходе, наблюдавшихся в клинике нефрологии, внутренних и профессиональных заболеваний им. Е.М. Тареева в период с ноября 2009 г. до июня 2014 г.

Критериями исключения из исследования были употребление алкоголя (>20 мл/сут для женщин и >40 мл/сут для мужчин), наличие дополнительных этиологических факторов поражения печени (коинфекция HBV, ВИЧ, болезнь Вильсона-Коновалова, аутоиммунный гепатит, наследственный гемохроматоз), сахарный диабет 1-го и 2-го типа.

Диагноз ХГС и ЦП устанавливали на основании данных анамнеза, клинического обследования, лабораторных и инструментальных результатов, включая вирусологическое исследование (положительные тесты на антитела к HCV и его РНК). При оценке данных анамнеза жизни и заболевания обращали внимание на наличие перенесенного острого вирусного гепатита, желтушной формы последнего и наиболее вероятного фактора риска инфицирования.

Пункционная биопсия печени с последующим морфологическим исследованием выполнена 98 больным, эластометрия печени - 52, еще 4 пациентам выполнен ФиброАктиТест («Biopredictive», Франция). По данным обследования, у 9 больных определена стадия фиброза F0 по METAVIR, у 53 - F1, у 21 - F2, еще у 21 и 50 - F3 и F4 соответственно. У 33 пациентов по клинико-диагностическим признакам диагностирован ЦП (F4). Скорость прогрессирования фиброза оценивали по формуле, предложенной Т. Poynard и соавт. [8]: скорость прогрессирования фиброза печени (ед. фиброза/год) = F/T, где F - стадия фиброза по METAVIR, Т - длительность инфицирования в годах.

Выделение геномной ДНК проводили из ЭДТА-стабилизированной периферической венозной крови согласно протоколу с помощью коммерческого набора QIAmp DNA Blood Mini Kit и автоматической станции QIAcube (QIAGEN).

Полиморфизм генов MTHFR 677 C/T, FII 20210 G/A, FV 1691G/A, FVII 10976 G/A, FXIII 103 G/T, ITGA2 807 C/T, ITGB3 1565 T/C, FBG -455 G/A, PAI -675 5G/4G определяли с помощью коммерческих наборов ДНК-технология, термоциклера DTprime и программного обеспечения для приборов ДТ (ДНК-технология).

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакетов статистических программ Statistica 10. Гипотезу о нормальности распределения исследуемых показателей проверяли с использованием критерия Шапиро-Уилка. Для каждой из непрерывных величин в зависимости от их типа распределения определяли либо среднее (M) и стандартное отклонение (σ), либо медиану и квартили распределения. При сравнении двух групп больных с «быстрым» и «медленным» прогрессированием фиброза по основным показателям (в зависимости от типа распределений анализируемых показателей) использовали непарный критерий t Стьюдента (для равных или неравных дисперсий) или его непараметрический аналог - критерий U Манна-Уитни. Для сравнения средних значений показателей в 3 и более независимых группах применяли дисперсионный анализ (ANOVA). В случаях, если распределение параметра существенно отклонялось от нормального или для малочисленных выборок использовали непараметрический аналог ANOVA - метод Крускала-Уоллиса. Для анализа таблиц сопряженности признаков 2×2 применяли двусторонний точный критерий Фишера, для остальных таблиц сопряженности - критерий Пирсона χ². Для построения точечной оценки отношения шансов (ОШ) и 95% доверительных интервалов (ДИ) применяли модель бинарной логистической регрессии. Уровень значимости для проверяемых гипотез принят равным 0,05.

Клинико-морфологическая характеристика обследованных больных. Из 188 больных с оцененной стадией фиброза данные о длительности инфицирования известны у 177. Для них рассчитана скорость прогрессирования фиброза: у 88 пациентов расчетный темп фиброза меньше 0,13 ед. фиброза/год и составил по медиане 0,074 ед. фиброза/год с интерквартильным размахом 0,047; 0,100, что позволило их отнести к группе с «медленным фиброзом». Группа «быстрого фиброза» (89 пациентов) имела скорость прогрессирования фиброза 0,13 и выше ед. фиброза/год, по медиане 0,200 (0,160; 0,286).

Больные с медленно прогрессирующим ХГС инфицированы в более раннем возрасте, имели более длительный срок инфицирования, чем пациенты с медленно прогрессирующим течением ХГС, причем выявленные различия статистически значимы (р<0,05). Средняя концентрация аланинаминотрансферазы и аспартатминотрансферазы у больных с «быстрым фиброзом» выше, однако различия лишь на уровне тенденции. Частота выявления 3 генотипов вируса выше в группе с «быстрым» фиброзом (р=0,022). В то же время нами не получено различий между группами при сравнении возраста, выявления гепатоцеллюлярной карциномы и обнаружения криоглобулинов. У 60,67% больных группы с «быстрым» фиброзом определена стадия ЦП.

Анализ связи между прогрессированием фиброза печени и носительством вариантных аллелей исследованных генов у больных ХГС. У больных с быстрым фиброзом достоверно чаще встречался гетерозиготный генотип GA гена FV по сравнению с пациентами с медленно прогрессирующим течением (ОШ 9,787 при 95% ДИ от 1,195 до 80,153; р=0,011; рис. 1). Так, из 89 человек группы «быстрого фиброза» 9 пациентов (10,11%) имели мутацию GA гена FV 1691G/A (лейденская мутация), в группе с «медленным фиброзом» данный генетический полиморфный маркер обнаружен только у 1 (1,14%) из 88 человек. Дикий генотип GG в данном случае являлся протективным (ОШ 0,207 при 95% ДИ от 0,043 до 0,997). В нашем исследовании только 1 человек из группы с низким темпом прогрессирования фиброза имел гомозиготный мутантный генотип AA гена FV 1691G/A. Аллель, А гена FV 1691 G/A на уровне тенденции чаще встречался в группе с прогрессирующим течением, чем в группе с медленно прогрессирующим течением ХГС (1,7% против 5,56%; р=0,139).

Полиморфный маркер GA гена FII 20210 G/A также чаще встречался в нашем исследовании в группе с «быстрым фиброзом» по сравнению с группой с «медленным фиброзом» (6,74% против 1,14%), частоты выявления этого генотипа имели лишь тенденцию (р=0,118). Мутантная гомозигота АА гена FII 20210 G/A не встречалась в исследуемой группе.

При сравнении распространенности генотипов и аллелей гена PAI -675 5G/4G в изучаемых группах установлено, что генотипы с аллелем 4G (5G4G+4G4G) и аллель 4G на уровне тенденции чаще встречались у больных с быстрым течением болезни, чем в группе сравнения (p=0,112 и p=0,117 соответственно).

Различий по распределению аллелей и генотипов генов MTHFR 677 C/T, FVII 10976 G/A, FXIII 103 G/T, ITGA2 807 C/T, ITGB3 1565 T/C, FBG -455 G/A между группами больных ХГС с разной скоростью процессов фиброза не выявлено.

Анализ комбинаций полиморфных маркеров исследованных генов. Известно, что на течение того или иного процесса в организме человека (включая прогрессирование фиброза в печени) влияют не только носительство мутантных аллелей тех или иных генов по отдельности, но и их сочетания, поэтому мы провели анализ комбинаций исследуемых генов.

На основании полученных данных о «негативной» роли генотипов GA гена FII 20210 G/A, GA гена FV 1691G/A и 5G4G+4G4G гена PAI-I -675 5G/4G на прогрессирование фиброза печени нами выделены благоприятные (или протективные) и неблагоприятные комбинации этих генотипов и проведен анализ влияния их носительства на течение болезни (табл. 1).

Для оценки прогностического характера развития фиброза в зависимости от различных генотипов пациентов по генам FII 20210 G/A и FV 1691 G/A сформирована система оценки в баллах. С появлением у пациента хотя бы одной мутантной аллели по этим генам возрастает вероятность быстрого прогресса фиброза печени:

0 - пациент имеет две гомозиготные доминантные аллели по обоим генам FII 20210 G/A (GG) и FV 1691 G/A (GG);

1 - пациент гомозиготен по гену FV 1691 G/A (GG), но гетерозиготен по гену FII 20210 G/A (GА);

2 - пациент гомозиготен по гену FII 20210 G/A (GG), гетерозиготен по гену FV 1691 G/A (GА);

3 - пациент гомозиготен по гену FII 20210 G/A (GG), имеет 2 мутантные аллели по гену FV 1691 G/A (АА).

Пациенты с другими комбинациями среди нашей выборки не встречались.

В группе с «быстрым» фиброзом чаще встречались комбинации FII (GA)-FV (GG) и FII (GG)-FV (GA) по сравнению с группой с «медленным» фиброзом (16,85% против 3,41%; р=0,008; (см. табл. 1).

Если дополнительно учитывать влияние полиморфизма PAI -675 5G/4G, то неблагоприятный генетический профиль с наличием одного и более мутантных генотипов 3 генов (GА генотип FII 20210 G/A, GА и АА генотипы FV 1691 G/A, 5G4G и 4G4G генотипы PAI -675 5G/4G) в группе с прогрессирующим течением ХГС выявлялся чаще, чем в группе с медленно прогрессирующим течением заболевания (85,27% против 71,59%; р=0,047).

В дальнейшем мы выполнили кодирование с присвоением генотипам с профиброгенными аллелями «+1» балла (GА генотип FII 20210 G/A, GА и АА генотипы FV 1691 G/A, 5G4G и 4G4G генотипы PAI -675 5G/4G). При суммировании всех профиброгенных генотипов (табл. 2) максимальное их количество (2) выявлялось у 7,91% больных. У 70% пациентов имелся 1 неблагоприятный генотип, а у остальных мутации отсутствовали. Затем по количеству баллов сформировали 3 группы больных (см. табл. 2). В каждой группе определена медиана скорости фиброза в печени. Из табл. 2 видно, что сформированные группы статистически значимо различаются по скорости фиброза (р=0,039). Методом множественных ранговых сравнений выявлен более высокий темп процессов фиброза в 3-й группе по сравнению с 1-й группой (р=0,042). Статистически значимых различий между 1-й и 2-й группами не выявлено (рис. 2).

В нашем исследовании полиморфизм гена FV 1691G/A ассоциирован с более высоким темпом прогрессирования фиброза печени у больных ХГС. Воспаление в ткани печени при ХГС связано с активацией системы свертывания, которая более выражена у пациентов с лейденской мутацией и приводит к повышенной активности тромбина и отложению фибрина. Тромбин является митогеном для звездчатых клеток печени, и активируя каскад свертывания, может стимулировать фиброз.

В своем исследовании M. Wright и соавт. [9] показали, что темпы прогрессирования фиброза значительно выше у пациентов с лейденской мутацией, что согласуется с нашими данными. При дальнейшем анализе авторами показано, что пациенты, у которых ЦП развивается в течение 15 лет, в 12,3 раза чаще имели лейденскую мутацию, чем те, у которых заболевание прогрессировало до ЦП в течение более 35 лет (p=0,0005). При использовании ковариационного анализа (ANCOVA) эффект полиморфизма гена FV 1691G/A оставался статистически значимым (р=0,007) даже с учетом возраста инфицирования (p<0,001), ИГА (p<0,001) и пола (p<0,001). Сходный результат получен в исследовании A. Poujol-Robert и соавт. [3], показавших, что у пациентов с лейденской мутацией практически в 4 раза выше риск развития Ц.П. По структуре эти данные сопоставимы с нашим исследованием, и этим могут объясняться одинаковые результаты. Однако в исследовании C. Goulding и соавт. [10], включавшем 111 ирландок с анти-D иммуноглобулином HCV генотипа 1b, связь между полиморфизмом гена FV 1691G/A и скоростью прогрессирования фиброза печени не выявлена. Расхождения в результатах первых двух и нашего исследований с данными C. Goulding и соавт. [3, 9] могут быть обусловлены начальными стадиями фиброза у женщин, в то время как эффект носительства полиморфизма гена фактора V 1691G/A в предыдущих исследованиях более выражен у мужчин.

Еще одним важным полиморфизмом является мутация в гене протромбина (FII) 20210 G/А, способствующая избыточному синтезу без изменения структуры протромбина. В описанных исследованиях не выявлена связь между скоростью прогрессирования фиброза печени и генотипами гена FII 20210 G/А, но, как и в нашей работе, наблюдалась тенденция к более частому выявлению гетерозиготных генотипов данного гена у пациентов с быстро прогрессирующим течением заболевания [9, 10]. Однако в исследовании N. Maharshak и соавт. [11] по данным однофакторного анализа выявлена взаимосвязь полиморфизма гена FII 20210 G/А и скорости прогрессирования фиброза (р=0,002), что затем подтверждено в модели множественной логистической регрессии (ОШ 4,76 при 95% ДИ от 1,13 до 19,99; р=0,033).

В Роттердамском исследовании (Rotterdam Study, 2015) 1055 европейцам выполняли фиброэластометрию печени и определяли полиморфизм генов протромбина 20210 G/A и FV 1691G/A [12]. Жесткость печени (liver stiffness - LS) более 8,0 кПа, свидетельствующая о клинически значимом фиброзе, обнаружена у 101 (9,6%) пациента. По результатам многофакторного регрессионного анализа носительство гетерозиготной мутации гена FV 1691G/A или протромбина 20210 G/A независимо ассоциировано с повышенным риском выявления LS ≥8,0 кПа (ОШ 2,09 при 95% от 1,07 до 4,07; р=0,03). В нашей работе у больных ХГС в группе с прогрессирующим течением заболевания один из двух полиморфных маркеров (FII 20210 G/A и FV 1691G/A) выявлялся в 5 раз чаще, чем в группе с медленно прогрессирующим темпом болезни (р=0,005).

Мутация гена FXIII 103 G/T ассоциирована с быстрой активацией тромбином фактора XIII. Наличие полиморфизма 103 G/T влияет на структуру и формирование тромба, в результате чего он становится прочнее, менее пористым и состоит из более коротких и тонких волокон [13]. Полиморфизм гена ингибитора активатора плазминогена II типа (PAI-I) 675 4G/5G приводит к повышению активности PAI-I и склонности к венозным тромбозам [14]. При данном полиморфизме уменьшается фибринолиз в связи с ингибированием тканевого активатора плазминогена, а в дальнейшем блокируется превращение плазминогена в плазмин.

K. Dik и соавт. [15] показали, что при мутации гена фактора XIII 103 G/T скорость развития фиброза печени увеличивается (р=0,01). Кроме того, показано, что при сочетании гетерозиготного состояния гена фактора XIII 103 G/T и аллеля 4G PAI-I 675 5G/4G данный показатель увеличивался еще больше (р=0,02). При распределении больных на группы с «быстрым» и «медленным» темпом прогрессирования фиброза пациенты с аллелями T гена FXIII 103 G/T и 4G гена PAI-I 675 5G/4G имели в 5 раз более высокий риск прогрессирующего течения заболевания, чем пациенты с дикими генотипами обоих генов (ОШ 5,00 при 95% ДИ от 1,25 до 20,08). В нашем исследовании статистически значимой связи между полиморфизмом генов FXIII 103 G/T и PAI-I 675 5G/4G и темпом прогрессирования фиброза в печени у пациентов не выявлено, однако отмечалась тенденция к более частому распространению аллелей Т и 4G этих генов и генотипов 5G4G и 4G4G гена PAI-I в группе с «быстрым» фиброзом по сравнению с группой с «медленным» фиброзом.

Полиморфизм гена FVII 10976 G/A приводит к снижению активности фактора VII и способствует уменьшению тромбообразования. Известно, что фибриноген является важным компонентом каскада свертывания и определяет вязкость крови и агрегацию тромбоцитов, он также влияет на функцию эндотелия и способствует пролиферации и миграции гладких мышечных клеток. В доступной литературе мы не обнаружили исследований по оценке влияния полиморфизма гена FVII 10976 G/A и FGB 455G/A на течение хронических заболеваний печени. В нашей работе не выявлено связи между аллелями и генотипами данных генов и скоростью фиброза в печени у больных ХГС.

Еще одним исследованным нами генетическим маркером является полиморфизм гена MTHFR 677 С/Т, в результате которого происходят повышение уровня гомоцистеина и повышение риска венозных и артериальных тромбозов. L. Adinolfi и соавт. [16] предполагают, что повышенный уровень гомоцистеина в результате формирования полиморфизма гена MTHFR 677 С/Т приводит к HCV-ассоциированному стеатозу, и по данным этих авторов гипергомоцистеинемия связана с ТТ генотипом гена MTHFR (r=0,367; р=0,001). При многофакторном анализе стеатоз независимо ассоциирован с гипергомоцистеинемией (ОШ 7,1), ИГА (ОШ 3,8), фиброзом в печени (ОШ 4,0), и 3-м генотипом вируса (ОШ 4,6), а фиброз в печени в свою очередь - с возрастом (р=0,03), индексом гистологической активности (р=0,0001) и стеатозом (р=0,007). Таким образом, генетические особенности влияют на скорость фиброза в печени опосредованно через развитие жировой инфильтрации. В другом исследовании не выявлено влияния полиморфизма гена MTHFR 677С/T реципиента на развитие стеатоза в трансплантате печени, но показано влияние данного полиморфизма на скорость фиброза [17]. В нашем исследовании распределение аллелей и генотипов полиморфизма 677 C/T гена MTHFR в группах больных ХГС с быстрым и медленным прогрессированием фиброза печени не различались между собой.

Влияние полиморфизма генов тромбоцитарных рецептов (интегринов, ITGB3 1565 T/C, ITGA2 807 C/T) на течение заболеваний печени исследовано недостаточно. Т. Asselah и соавт. [18] при изучении экспрессии 240 генов в ткани печени больных с гепатитом С выявили повышение количества мРНК ITGA2 в биопсийном материале у пациентов с развернутой стадией фиброза (р=0,000). Однако полиморфизмы генов тромбоцитарных рецептов в данной работе не исследованы. М. Nejjari и соавт. [19] предполагают, что активация системы интегринов играет в профибротических процессах более важную роль, чем воспаление. Мы не выявили влияния аллельных вариантов генов тромбоцитарных рецепторов ITGA2 807 C/T и ITGB3 1565 T/C на скорость прогрессирования фиброза в печени.

Генетический полиморфизм генов системы гемостаза является фактором, определяющим индивидуальные особенности прогрессирования фиброза у больных ХГС. В данной работе установлены генотипы, ассоциированные с прогрессирующим вариантом течения ХГС - «профибротические» (GА генотип FII 20210 G/A, GА и АА генотипы FV 1691 G/A, 5G4G и 4G4G генотипы PAI -675 5G/4G). Кроме того, выявлено, что при увеличении количества мутантных профибротических генотипов данных 3 генов возрастает риск быстрого прогрессирования фиброза в печени при ХГС. Определение полиморфизма генов тромбофилии поможет прогнозировать течение заболевания у больных ХГС, определять сроки медицинского вмешательства и начала терапии.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 14−50−00029)

Конфликт интересов отсутствует.