алло-ТГСК — трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток

БРВ — безрецидивная выживаемость

БСВ — бессобытийная выживаемость

ГСК — гемопоэтические стволовые клетки

МДС — миелодиспластические синдромы

ОВ — общая выживаемость

ОМЛ — острые миелоидные лейкозы

ХМЛ — хронический миелолейкоз

ХММЛ — хронический миеломоноцитарный лейкоз

KIR — киллерные иммуноглобулиноподобные рецепторы

NK-клетки — натуральные киллерные клетки

Цель трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК) — излечение больного. Совершенствование протоколов лечения больных гемобластозами снизило летальность при алло-ТГСК, увеличило безрецидивную выживаемость (БРВ) и продолжительность жизни больных после ТГСК. Однако рецидивы заболевания до сих пор являются одной из основных причин смерти пациентов после ТГСК [1—3].

Натуральные киллерные клетки (NK-клетки) — первая популяция лимфоцитов по времени восстановления после алло-ТГСК. Аллореактивные NK-клетки опосредуют снижение частоты развития реакции трансплантат против хозяина, риска отторжения трансплантата (путем лизиса Т-клеток хозяина), уменьшение частоты рецидива, улучшение приживаемости трансплантата и снижение частоты развития инфекционных осложнений [4, 5]. NK-клетки лизируют клетки со сниженной экспрессией HLA-молекул I класса, подобных собственным, без предварительного контакта и развития иммунного ответа. Гены KIR (killer cell immunoglobulin like receptors — киллерные иммуноглобулиноподобные рецепторы) кодируют рецепторы, посредством которых NK-клетки распознают HLA-молекулы I класса. Гены KIR располагаются на хромосоме 19q13.4 и наследуются независимо от генов HLA, располагающихся на хромосоме 6р21.3. В зависимости от количества и типа генов гаплотипы KIR (набор генов KIR на одной хромосоме) делятся на гаплотипы, А и В [6]. Гаплотипы, А имеют фиксированное содержание генов: это ингибиторные гены 2DL1, 2DL3, 2DL4, 3DL1, 3DL2, 3DL3 (в названии ингибиторных генов содержится буква L) и только один активационный — KIR2DS4 (активационные гены обозначаются буквой S). Гаплотипы В отличаются вариабельным содержанием генов и наличием генов, специфичных для гаплотипов В: KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR2DL2, KIR2DL5, KIR3DS1 (рис. 1). Все индивидуумы делятся на обладателей генотипов А/A генов KIR (гомозигот по гаплотипам А) и носителей генотипов В/х (имеют 1 или 2 гаплотипа В из 2 возможных).

Распознавание ингибиторными KIR лигандов HLA обеспечивает толерантность к собственным клеткам с нормальной экспрессией молекул HLA. Функционально компетентными (лицензированными) становятся NK-клетки с KIR, для которых имеется соответствующий лиганд HLA в геноме собственного организма. NK-клетки с KIR, для которых отсутствует соответствующий лиганд HLA, являются гипореактивными (нелицензированными). Молекулы HLA-С диморфны по положению 80 пептидсвязывающей бороздки, аллели с аспарагином в положении 80 пептидсвязывающей бороздки относятся к группе HLA-С1 и являются лигандами KIR2DL2/3; аллели, несущие лизин, относятся к группе HLA-С2 и являются лигандами KIR2DL1 и KIR2DS1. Молекулы HLA-Bw4 — лиганды KIR3DL1/3DS1, а HLA-A3/11 — лиганды KIR3DL2. Лиганды большинства активационных KIR окончательно не определены. Количество генов KIR, их полиморфизм, распределение комбинаций KIR/HLA различны у разных этнических групп [7, 8].

С NK-аллореактивностью связывают наличие эффекта трансплантат против лейкоза при гаплоидентичных по HLA [9] и частично совместимых неродственных трансплантациях [10]. При идентичных по HLA трансплантациях NK-аллореактивность обусловливается иными механизмами, в отношении которых нет единой точки зрения [11]. Вероятно, после идентичной по HLA ТГСК в период реконституции гемопоэза нелицензированные NK-клетки становятся на время функционально компетентными и аллореактивными в отношении клеток с отсутствующим лигандом HLA [12—15]. Наличие у донора генов гаплотипов В улучшает БРВ у больных острыми миелоидными лейкозами (ОМЛ) после алло-ТГСК от идентичного по HLA родственного и совместимого по HLA неродственного донора [16, 17]. Протективное действие связывают как с наличием у донора генов KIR из центромерной области гаплотипов В [18], так и с генами теломерной области гаплотипов В [19—21], однако имеются также сообщения, что риск развития рецидива, напротив, уменьшается при ТГСК от доноров с генотипом А/А и низким числом активационных генов KIR [22, 23]. Наличие лигандов HLA-C2 ухудшает общую выживаемость (ОВ) и/или БРВ у больных миелоидными лейкозами [20, 24—27]. Этот эффект проявляется в первые 500 дней после ТГСК [25]. Практически все приведенные исследования являются ретроспективными.

Цель данного проспективного исследования — изучить влияние генов KIR донора и лигандов HLA KIR на ОВ и бессобытийную выживаемость (БСВ) у больных миелоидными лейкозами после алло-ТГСК от идентичных по HLA родственных и совместимых по HLA неродственных доноров.

В исследование включили 29 пациентов, которым в 2010—2013 гг. в отделении трансплантации костного мозга Гематологического научного центра выполнена алло-ТГСК. Характеристика больных представлена в табл. 1.

Диагнозы: ОМЛ, МДС, ХМЛ, ХММЛ. Категории риска развития рецидива — стандартная и высокая. Стандартный риск — ОМЛ в первой ремиссии, хроническая фаза ХМЛ, ХММЛ; МДС (рефрактерная анемия/рефрактерная анемия с кольцевыми сидеробластами). Высокий риск — острый лейкоз вне первой ремиссии; ОМЛ, связанный с терапией предшествующего онкологического заболевания — «вторичный» ОМЛ. У 19 пациентов алло-ТГСК выполнена от идентичного по HLA сиблинга, 10 больным — от совместимого по HLA неродственного донора (матч 10/10). Источником трансплантата служили периферические стволовые клетки и костный мозг. Больные, которым трансплантация проведена от неродственного донора, были полностью совместимы с донором по 5 генам HLA-A/B/C/DRB1/DQB1 на уровне высокого разрешения (с идентичной нуклеотидной последовательностью, кодирующей пептидсвязывающую бороздку молекул HLA). При алло-ТГСК от неродственного донора при кондиционировании дополнительно применяли анти-Т-лимфоцитарный глобулин. Все доноры (как и пациенты) относились к европеоидной расе.

Геномную ДНК получали из периферической крови с использованием наборов для выделения ДНК «Invitrogen» (США). При родственной ТГСК идентичность по HLA больного и сиблинга устанавливали путем HLA-типирования генов HLA-А*-B*-C* при среднем разрешении методом полимеразной цепной реакции с сиквенсспецифическими праймерами («Olerup», Швеция или «Invitrogen», США) в соответствии с рекомендациями производителя, которые дополнялись типированием с высоким разрешением в случаях гомозиготности и обязательным типированием с высоким разрешением генов HLA-DRB1*-DQB1*. При неродственной ТГСК подтверждающее типирование HLA проводили методом типирования, основанного на полимеразной цепной реакции с дальнейшим секвенированием c высоким разрешением на наборах Protrans S4 (Германия).

Для генотипирования KIR доноров гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) — идентичных по HLA сиблингов использовали тот же образец ДНК, который применяли для типирования HLA. Генотипирование KIR проводили в те же сроки, что и типирование HLA. ДНК неродственных доноров получали из 1 мл клеточной взвеси, оставшейся после инфузии трансплантата ГСК. Генотипирование KIR геномной ДНК проводили с помощью наборов KIR Genotyping SSP Kit («Invitrogen», США) в соответствии с рекомендациями производителя. Выявляли наличие KIR: 2DL1, 2DL2, 2DL3, 2DL4, 2DL5A, 2DL5B, 2DS1, 2DS2, 2DS3, 2DS4, 2DS5, 3DL1, 3DL2, 3DL3, 3DS1, 2DP1, 3DP1. Генотип KIR определяли в зависимости от наличия генов KIR: А/А (гомозиготы по гаплотипам А) или В/х (т.е., гомозиготы по гаплотипам В — В/В + гетерозиготы — А/В).

Статистическую обработку полученных данных выполняли с помощью пакета SAS 9.3. ОВ и БСВ рассчитывали по методу Каплана—Мейера. Значимые события: для ОВ — летальный исход, для БСВ — рецидив (как молекулярный, так и гематологический), отторжение трансплантата и летальный исход. Последняя информация о пациентах — март 2014 г. У всех больных, если не наступило событие, срок наблюдения до даты последней информации превышал 8 мес, максимальный срок наблюдения — 44 мес. Для оценки статистической значимости различий по выживаемости использовали логранговый критерий.

Из 29 больных, включенных в исследование, на 1 марта 2014 г. живы 19, умерли 10; 3-летняя ОВ составила 59,7% (рис. 2).

Проведенный анализ показал, что основным фактором, влиявшим как на ОВ, так и БСВ больных, была группа риска развития рецидива, в которую относили больных перед алло-ТГСК (рис. 3, а). Среди обследованных больных 21 относился к группе со стандартным риском развития рецидива, 8 — к группе высокого риска (больные ОМЛ вне первой ремиссии и больные «вторичным» ОМЛ). Больные из группы стандартного риска за время наблюдения не достигли медианы продолжительности жизни. Все больные из группы высокого риска умерли, медиана их продолжительности жизни после алло-ТГСК составила 7 мес.

3-Летняя БСВ после алло-ТГСК всех больных, включенных в исследование, равнялась 50%, у больных со стандартным риском — 69%, у больных с высоким риском — 0 (см. рис. 3, б). У больных со стандартным риском за время наблюдения медиана БСВ не достигнута, у больных с высоким риском развития рецидива она составила всего 3 мес.

Таким образом, принадлежность больного к группе высокого риска является основным фактором для прогноза вероятности рецидива и продолжительности жизни. Группа высокого риска не столь многочисленна, однако остается вопрос, имеются ли дополнительные факторы, влияющие на прогноз в группе стандартного риска. По нашим данным, такие факторы, как режим кондиционирования и тип алло-ТГСК (родственная или неродственная), не оказывают существенного влияния на выживаемость больных из группы стандартного риска.

Проанализировано возможное влияние иммуногенетических показателей на БСВ после алло-ТГСК у больных этой группы. Оценивали влияние генотипа KIR донора (А/А или В/х), наличие у донора генов центромерного и теломерного регионов гаплотипов В, наличия лигандов HLA: HLA-С1, HLA-С2 и HLA-Bw4, а также и отсутствие хотя бы одного лиганда HLA из 3: HLA-Bw4, HLA-C1 или HLA-C2 (к С2 группе относятся молекулы HLA-С*02, -C*05, -C*17, -C*18, -С*03:07/10/15, -C*07:07/09, -C*08:10, -C*12:04/05/09, -C*15:07, -C*16:02 и большинство молекул HLA-С*04, -С*06, -С*15. Остальные молекулы HLA-C относятся к группе HLA-С1).

Небольшой объем исследования не позволил обнаружить статистически значимого влияния на продолжительность жизни больных после алло-ТГСК большинства иммуногенетических показателей (табл. 2).

Однако обнаружена отчетливая тенденция к повышению БСВ у больных, доноры которых обладали генами теломерной части KIR-B-гаплотипов (KIR tel B+): 89% против 56% (р=0,08), что представлено на рис. 4.

Отсутствие какого-либо лиганда HLA (HLA-С1+ HLA-С2+ HLA-Bw4) в совокупности не оказывало статистически значимого влияния на БСВ, однако у больных без лигандов HLA-C2, т. е. гомозиготных по HLA-C1 (С1/С1), наблюдалась тенденция к повышению БСВ (рис. 5). 3-Летняя БСВ у этих пациентов составила 89% против 56% у больных, которые являлись носителями лигандов HLA-С2 (HLA-C1/С2 + HLA-C2/С2). Больные — носители HLA-Bw4 также имели несколько сниженную БСВ, 3-летняя БСВ у больных без HLA-Bw4 достигала 89%, у больных — носителей HLA-Bw4 — 56% (рис. 6).

Исследование остальных иммуногенетических показателей (А/А или В/х KIR-генотип донора, гомозиготность больных по HLA-C2, т. е. отсутствие HLA-C1-лигандов) не выявило их сколько-нибудь существенного влияния на БСВ после алло-ТГСК у больных со стандартным риском.

Очевидна взаимосвязь исследованных иммуногенетических показателей между собой, однако небольшой объем исследования не позволяет провести многофакторный анализ выживаемости и выделить наиболее статистически значимые и независимо действующие факторы. Это предстоит сделать после накопления данных необходимого объема.

Известно, что результаты алло-ТГСК у больных острыми лейкозами, выполненной в первой полной ремиссии, значительно лучше результатов у пациентов с другими стадиями на момент алло-ТГСК [1]. В нашем исследовании доминирующим прогностическим фактором, влияющим на ОВ и БСВ после алло-ТГСК у больных миелоидными лейкозами, являлась группа риска развития рецидива, к которой относится пациент перед трансплантацией.

У больных со стандартным риском 3-летняя БСВ после алло-ТГСК достигла 69,3%, а шансы пациентов пережить 3-летний рубеж (ОВ) равнялись 85,7%. В группе высокого риска у всех больных развился ранний (в сроки до 6 мес) рецидив после ТГСК, и ни один больной не прожил больше 20 мес.

Конечно, при идентичных по HLA и совместимых по HLA ТГСК иммуногенетические факторы не играют столь значительной роли, как при HLA-гаплоидентичных и частично совместимых трансплантациях. Однако некоторые из исследованных показателей оказали влияние на результаты ТГСК от идентичных по HLA родственных и полностью совместимых по HLA неродственных доноров у больных миелоидными лейкозами из группы стандартного риска.

На результатах алло-ТГСК у больных из группы стандартного риска благоприятно сказывалось наличие в генотипе KIR донора генов теломерной части гаплотипов B, которое сопровождалось увеличением БСВ больных. Возможно, что положительное влияние связано с наличием гена KIR2DS1, который участвует как в активации NK-клеток, так и в развитии их толерантности [20]. Имеются сообщения, что наличие KIR2DS1 у донора препятствует развитию рецидива у больных, не являющихся гомозиготами по HLA-C2 [20, 28]. Положительное влияние на уменьшение смертности [20] и частоты рецидива [21] после алло-ТГСК отмечено и у больных, доноры которых обладали геном KIR3DS1, однако этот ген находится в неравновесном сцеплении с геном KIR2DS1, поэтому оценить раздельно влияние этих генов сложно.

Отсутствие лигандов HLA-С2 для KIR2DL1 (гомозиготность по HLA-C1) сопровождалось тенденцией к повышению БСВ больных после алло-ТГСК по сравнению с больными — носителями HLA-C2. Ингибиторные KIR обладают разным сродством к своим лигандам HLA-C [29]. Наибольшим сродством отличается рецептор для HLA-C2 — KIR2DL1, поэтому NK-клетки с KIR2DL1 получают более сильный ингибиторный сигнал (через взаимодействие с молекулой HLA-C2) по сравнению с NK-клетками, ингибиторные сигналы которых генерируются через взаимодействие KIR2DL3—HLA-C1. Вероятно, что NK-клетки с рецептором KIR2DL1 более супрессированы и их контроль за лейкемическими клетками при наличии лигандов HLA-C2 менее эффективен.

Нельзя также отбросить гипотезу, согласно которой во время реконституции гемопоэза после ТГСК отсутствие лигандов HLA-C2 для KIR2DL1 донора и HLA-Bw4 для KIR3DL1 может вызывать развитие аллореактивности в отношении клеток без лиганда даже у нелицензированных NK-клеток, становящихся на время функционально компетентными, что способствует эрадикации лейкозных клеток [14, 30]. В данном случае речь идет о временно компетентных нелицензированных NK-клетках, поскольку теоретически NK-клетки, развивающиеся в отсутствие лиганда HLA, являются функционально некомпетентными (нелицензированными), и, следовательно, толерантными к отсутствующему лиганду. Вероятно, что при ТГСК происходит срыв этой толерантности.

Проведенное исследование позволяет сделать предположение, что иммуногенетический комплекс KIR + лиганды HLA оказывает влияние на результаты алло-ТГСК от идентичного по HLA родственного и совместимого по HLA неродственного донора у больных миелоидными лейкозами со стандартным риском.

Доноры, обладающие генами теломерной части KIR-В-гаплотипов, более предпочтительны для алло-ТГСК больным миелоидными лейкозами, так как присутствие генов теломерной области KIR-В-гаплотипов у донора оказывает благоприятное влияние на результаты трансплантации, повышая БСВ у больных со стандартным риском.

Основным фактором, влияющим на выживаемость после алло-ТГСК, является группа риска, к которой относится больной перед трансплантацией.