Цереброваскулярные заболевания занимают лидирующие позиции в большинстве стран мира среди всех причин инвалидности и смертности [1]. Согласно данным ВОЗ, ежегодно в мире более 6 млн человек умирают от мозгового инсульта (МИ) [2]. С точки зрения медицинской генетики МИ является полигенным мультифакторным заболеванием, предрасположенность к которому определяется аллельными вариантами множества генов, определяющими риск возникновения болезни при взаимодействии с определенными факторами риска (ФР), такими, как гипертоническая болезнь (ГБ), сахарный диабет, повышенное употребление поваренной соли, гиподинамия; кроме того, существует прямая связь между уровнем артериального давления (АД) и риском развития инсульта [3].

Спектр генов-кандидатов, ассоциированных с острым нарушением мозгового кровообращения (ОНМК), разнообразен: гены ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС), гены липидного обмена, гены, регулирующие функцию эндотелия, кодирующие выработку ферментов или транспортных белков, гены - регуляторы гемостаза [4]. С учетом роли ГБ - ключевого ФР развития МИ в патогенезе ОНМК исследование полиморфных маркеров генов РААС как независимых ФР развития МИ признано наиболее актуальным [5, 6]. Из числа генов - кандидатов РААС, связанных с риском развития МИ, большой научный интерес для исследований представляет ген ангиотензиногена (AGT) - сывороточного глобулина, вовлеченного в регуляторные механизмы РААС. В исследовании T. Nakajima и соавт. [7] идентифицировано 44 однонуклеотидных полиморфизма гена AGT, включая микросателлиты, однако наиболее патогенетически значимыми и изученными являются полиморфизмы M235T и T174M, расположенные в кодирующей области гена во 2-м экзоне.

Функциональная значимость полиморфизмов послужила основанием для исследования их роли в формировании предрасположенности к МИ в различных популяциях мира. В нескольких исследованиях [8, 9] обнаружена взаимосвязь полиморфизма M235T гена AGT и повышенного риска развития МИ. В то же время в работах L. Tiret и соавт. [10], К. Yamakawa-Kobayashi и соавт. [11], J. Barley и соавт. [12], M. Usacheva и соавт. [13] патогенетическая взаимосвязь аллельного варианта M235T и предрасположенности к МИ не подтвердилась. Ассоциации полиморфного маркера T174M гена AGT с риском развития МИ тестировались в ряде исследований, однако не обнаружено ассоциации данного локуса с риском развития болезни [5, 14] и даже выявлен протективный эффект вариантного аллеля 174M [15].

Таким образом, данные о взаимосвязи полиморфизмов M235T и T174M гена AGT и риска развития МИ противоречивы, а исследования выполнены на генетически гетерогенных популяциях и зачастую на относительно небольших выборках пациентов. Изложенное обусловливает необходимость проведения подтверждающих исследований ассоциации полиморфизмов M235T и T174M гена AGT с риском развития МИ в различных популяциях мира.

Цель настоящей работы заключалась в изучении связи полиморфизмов M235T и T174M гена AGT с развитием МИ у русских жителей Центрального Черноземья.

Материалом для исследования послужила выборка неродственных индивидуумов, проживающих в Курской области, общей численностью 638 человек. Сбор материала для исследования осуществляли в 2 этапа: в исследование вошли 234 пациента с МИ, которые находились на стационарном лечении в неврологических отделениях Курской областной клинической больницы и городской больницы скорой медицинской помощи Курска в период с 2007 по 2010 г. [16], а также 119 пациентов, проходивших лечение в Региональном сосудистом центре Курской областной клинической больницы в 2012-2013 гг. Среди 353 пациентов с диагнозом «мозговой инсульт» геморрагический инсульт перенесли 23 пациента, ишемический инсульт (ИИ) - 330. Диагноз МИ устанавливался квалифицированными неврологами на основании данных неврологического статуса и результатов магнитно-резонансной томографии головного мозга. В исследование не включали пациентов с хроническими болезнями сердца, почек, эндокринными, онкологическими и другими заболеваниями, которые могли быть причиной ОНМК. У всех пациентов с МИ имелась ГБ в анамнезе и все получали гипотензивную терапию. Контрольную группу составили 285 человек без хронических заболеваний в анамнезе с нормальным уровнем АД [17]. Средний возраст больных группы МИ (198 мужчин, 155 женщин) составил 61,2±10,4 года, пациентов контрольной группы (169 мужчин, 116 женщин) - 62,3±8,2 года, группы были сопоставимы по полу и по возрасту.

У всех обследованных брали образцы венозной крови. Геномную ДНК выделяли стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции. Генотипирование полиморфизма М235T AGT (rs 699) проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени путем дискриминации аллелей с помощью TaqMan-зондов на амплификаторе CFX96 («Bio-Rad») с использованием праймеров и зондов, синтезированных компанией «Синтол» (Москва). Генотипирование полиморфизма Т174М (rs4762) гена AGT осуществляли методом ПЦР и рестрикционного анализа согласно протоколам, описанным в литературе [14]. Для оценки ассоциаций аллелей и генотипов с риском развития МИ использовали критерий χ² и отношение шансов (ОШ) с 95% доверительным интервалом (ДИ).

Статистическую обработку данных проводили с использованием программных пакетов Statistica for Windows 8.0 («StatSoft») и Excel 2007 («Microsoft»).

Отклонения частот аллелей и генотипов полиморфизмов M235T и T174M гена AGT от популяционного равновесия Харди-Вайнберга в основной и контрольной группах не наблюдалось. Сравнительный анализ частот аллелей исследуемых полиморфизмов гена AGT в группах больных ИИ и здоровых индивидуумов отражены в табл. 1.

Статистически значимых различий по частотам аллелей и генотипов полиморфизма М235Т между группами не установлено. Мы обнаружили статистически значимое преобладание мутантного аллеля 174M гена AGT в группе больных МИ (р=0,02; ОШ 1,42 при 95% ДИ от 1,05 до 1,92). Уровень гетерозигот 174ТМ был выше в группе больных МИ (р=0,02; ОШ 1,52 при 95% ДИ от 1,08 до 2,15). В то же время частота гомозиготного генотипа по аллелю дикого типа 174ТТ у больных МИ была ниже, чем у здоровых индивидуумов (р=0,01; ОШ 1,54 при 95%ДИ от 1,09 до 2,16).

Учитывая вероятность проявления полового диморфизма, мы провели стратифицированный анализ исследуемых полиморфизмов по полу (табл. 2).

У мужчин мы не обнаружили статистически значимых различий по частотам аллелей и генотипов между исследуемыми группами. Можно отметить лишь тенденцию к накоплению гетерозигот по полиморфному маркеру Т174М в группе больных МИ (р=0,09; ОШ 1,47 при 95% ДИ от 0,94 до 2,31). В то же время у женщин мы наблюдали существенное увеличение частоты мутантного аллеля 174M данного полиморфизма (р=0,01; ОШ 1,86 при 95% ДИ от 1,14 до 3,03). При сравнении частот генотипов исследованных полиморфизмов гена AGT в исследуемых группах женщин наблюдалось преобладание гомозигот по дикому типу 174ТТ в контрольной группе по сравнению с больными МИ (р=0,02; ОШ 1,86 при 95% ДИ от 1,09 до 3,20). Кроме того, следует отметить тенденцию к накоплению гетерозигот 174ТМ в группе больных женщин, хотя различия не достигали уровня статистической значимости (р=0,08; ОШ 1,62 при 95% ДИ от 0,94 до 2,79). Частота мутантного генотипа 174ММ составила в группе больных МИ 3,2%. В то же время в контрольной группе не обнаружено мутантных гомозигот.

Ген AGT локализован на длинном плече 1-й хромосомы в локусе 1q42-q43, содержит 5 экзонов молекулярной массой 62-65 кДа [18]. В результате действия ренина от ангиотензиногена (АГТ) отщепляется концевой декапептид, который и представляет собой ангиотензин I. Он преобразуется в ангиотензин II (АТII) под действием ангиотензинпревращающего фермента (АПФ). АТII, присутствуя в крови в высоких концентрациях, оказывает мощное вазоконстрикторное действие, стимулирует высвобождение вазопрессина и кортикотропин-рилизинг-фактора в центральной нервной системе. В результате активации рецепторов АТII 1-го типа реализуются такие эффекты АТII, как вазоконстрикция и стимуляция роста кардиомиоцитов. Кроме того, активация рецепторов ATII 1-го типа стимулирует процессы накопления внеклеточного коллагенового матрикса и фиброз [19].

В рамках настоящего исследования мы изучили ассоциацию двух наиболее функционально значимых полиморфизмов M235T и T174M в кодирующей части гена AGT с развитием МИ у русских жителей Центрального Черноземья. Мы не обнаружили ассоциацию полиморфного маркера M235T гена AGT с риском развития МИ, что согласуется с результатами исследований, проведенных в Японии [20] и США [21], и не подтверждает результаты, полученные отдельными исследователями [15, 22, 23]. Так, В. Wang и соавт. [24] провели метаанализ, цель которого изучение связи М235Т полиморфизма гена AGT и риска развития ИИ. Обнаружена ассоциация аллеля 235T с ИИ в северной популяции Китая. Еще один метаанализ 6 исследований, включавших 891 пациента с ИИ и 727 лиц контрольной группы, выявил, что носительство генотипа TT полиморфизма M235T является значимым генетическим фактором развития ИИ у жителей Восточной Азии [25]. Другой метаанализ 38 исследований у жителей Восточной Азии подтвердил данные результаты [26]. В работе S. Saidi и соавт. [5] проводился поиск ассоциаций между полиморфизмом промоторного региона гена AGT –6G/А, полиморфизмами Т174М и М235Т с ИИ по атеротромботическому типу. Обнаружена связь полиморфизма –6G/А и М235Т гена AGT с ИИ в отличие от полиморфизма Т174М. Однако статистически значимой ассоциации полиморфизма T174M с риском развития МИ в других исследованиях также не обнаружено [14], а некоторые исследователи, как уже отмечалось, выявили даже защитный эффект аллеля 174М в отношении риска развития болезни [15].

Фактически в рамках проведенной нами работы впервые обнаружена связь полиморфизма T174M гена AGT с риском развития МИ, а также показан половой диморфизм в ассоциации данного генетического маркера с заболеванием. Известно, что РААС напрямую вовлечена в патогенез сердечно-сосудистых заболеваний преимущественно за счет регуляции тонуса кровеносных сосудов и поддержания водно-солевого гомеостаза [27]. У всех больных исследуемой нами выборки МИ развивался на фоне ГБ - ведущего ФР развития МИ [28]. В этой связи трудно разграничить влияния исследуемых полиморфизмов и самой ГБ на риск развития МИ. Множество различных исследований доказали влияние полиморфных вариантов генов РААС на уровень АД и водно-солевой обмен [23, 29]. Кроме того, обнаружена положительная корреляция между полиморфными вариантами гена AGT с концентрацией АГТ в плазме крови и риском развития ГБ [29, 30]. Доказано, что у больных артериальной гипертонией отмечается более высокий уровень АГТ в плазме крови, который коррелирует с уровнем АД [31]. Примечательно, что X. Jeunemaitre и соавт. [29] обнаружили значительное увеличение частот аллелей 174М и генотипа 174ТМ у больных ГБ, в то время как уровень AGT был почти такой же, как у гомозигот 174ТТ. Другие исследователи также не обнаружили связи данного полиморфного маркера с уровнем АГТ [32]. Полиморфизм М235Т связан с высоким уровнем АГТ в плазме крови [9, 29]. Можно предположить, что выявленная нами ассоциация варианта Т174М обусловлена функциональным эффектом полиморфизма M235T гена AGT вследствие наличия неравновесия по сцеплению между этими локусами. В частности, согласно результатам проведенного нами исследования полиморфизм T174M находился в положительном неравновесии по сцеплению с вариантом M235T гена AGT у больных МИ, т.е. вариантный аллель 174M сцеплен с вариантным аллелем 235T, который сопряжен с повышенной концентрацией АГТ в крови [9, 29]. В связи с этим можно предположить, что носители аллельного варианта 174M имеют повышенную концентрацию АГТ и, соответственно, высокую активность РААС, которая патогенетически может быть связана с развитием МИ [15]. Таким образом, полиморфный вариант T174M гена AGT - один из генетических модуляторов активности РААС, а АГТ, участвуя в регуляции АД, может быть напрямую вовлечен в патогенез МИ [33].

Отметим, что нами обнаружены четкие половые различия ассоциации полиморфного маркера T174M с риском развития МИ. Полученные результаты свидетельствуют о том, что пол может модулировать фенотипические эффекты данного локуса, однако механизмы этих эффектов неясны. В некоторых исследованиях показано, что гены РААС проявляют более выраженные ассоциации с АГ у мужчин [34], в других наиболее сильная связь генов данного класса обнаружена у женщин [35]. Согласно полученным нами результатам полиморфизм Т174М гена AGT ассоциирован с риском развития МИ у женщин и не связан с таковым у мужчин. В литературе имеются данные о том, что эстрогены могут принимать участие в регуляции и активации РААС [36]. Так, доказано влияние эстрогенов на промоторную часть гена AGT, что проявляется в усилении транскрипции гена и стимуляции синтеза АГТ [37], а это может частично объяснить обнаруженный нами половой диморфизм в ассоциации данного гена с риском развития инсульта.

Результаты нашего исследования свидетельствуют о статистически значимом влиянии полиморфизма T174M гена AGT на риск развития МИ у русских жителей Центрального Черноземья и подтверждают данные о существовании генетической гетерогенности различных популяций мира в отношении предрасположенности к заболеванию. Полученные данные могут быть востребованы при разработке критериев вероятностного прогнозирования риска развития нарушений мозгового кровообращения в рамках персонализированной медицины, направленной на раннюю диагностику данной патологии, формирование среди населения групп риска развития МИ с последующим применением лечебно-профилактических мероприятий.

Работа выполнена в рамках реализации Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России».