АРЭ — антагонисты рецепторов эндотелина

ДЗЛА — давление заклинивания легочной артерии

ДЛА — давление в легочной артерии

ДЛА_ср. — среднее ДЛА

ИЛГ — идиопатическая легочная гипертония

КПОС — катетеризация правых отделов сердца

ЛА — легочная артерия

ЛАГ — легочная артериальная гипертония

ЛСС — легочное сосудистое сопротивление

П6-МХ — проба с 6-минутной ходьбой

СДЛА — систолическое давление в легочной артерии

СИ — сердечный индекс

ФАН — фагоцитарная активность нейтрофилов

ФК — функциональный класс

ФР — фагоцитарный резерв

ФЧ — фагоцитарное число

ЭТ-1 — эндотелин-1

ЭхоКГ — эхокардиография

SaO₂ — насыщение кислородом артериальной крови

γ-ИФН — γ-интерферон

Идиопатическая легочная гипертензия (ИЛГ)^[*] — редкое тяжелое заболевание неизвестной этиологии, характеризующееся выраженным повышением легочного сосудистого сопротивления (ЛСС), давления в легочной артерии (ДЛА) вследствие поражения мелких легочных артерий и артериол, что приводит к развитию правожелудочковой сердечной недостаточности и преждевременной смерти пациентов. Диагностическими критериями ИЛГ являются подъем среднего ДЛА (ДЛА_ср.) выше 25 мм рт.ст. в покое и нормальное давление заклинивания легочной артерии (ДЗЛА) до 12 мм рт.ст. Диагноз ИЛГ устанавливается при исключении всех других возможных причин повышения ДЛА [1].

Дисфункция эндотелия, приводящая к дисбалансу вазоактивных медиаторов с вазодилатирующими и вазоконстриктивными свойствами в пользу последних, считается ключевым звеном патогенеза ИЛГ [2]. Возможным пусковым механизмом повреждения эндотелия рассматривается воспалительный процесс [3]. Морфологическая картина ИЛГ характеризуется формированием плексиформных структур, которые часто окружены T- и B-лимфоцитами, макрофагами и тучными клетками [4]. Т-клетки в данной ситуации выступают «оркестрантами» воспалительного процесса. При этом важность B-лимфоцитарного звена объясняется не только тем, что эти клетки могут дифференцироваться в плазматические с последующей продукцией антител (в том числе аутоантител к эндотелию), но и возможностью осуществлять B-лимфоцитами презентацию антигенов, продуцировать различные цитокины, участвовать в дифференцировке T-клеток [5]. Это подтверждает важную роль клеточного звена иммунной системы в формировании морфологической картины ИЛГ.

В процессе воспаления повреждаются клетки эндотелия сосудов, нарушается образование ими вазодилататоров (оксида азота, простациклина) наряду с повышенным образованием эндотелина-1 (ЭТ-1) [1, 6]. ЭТ-1— наиболее мощный и длительно действующий эндогенный пептид с вазоконстриктивными свойствами, который дает митогенный эффект по отношению к гладким мышечным клеткам сосудистой стенки [7]. Провоспалительные эффекты ЭТ-1 связаны с увеличением сосудистой проницаемости, активацией нейтрофилов и тучных клеток, стимуляцией продукции цитокинов и индукцией экспрессии интегринов, способностью повышать миграцию и адгезию клеток [8].

Активация системы эндотелина у больных ИЛГ служит предпосылкой использования антагонистов рецепторов эндотелина (АРЭ) для лечения больных этой категории. Применение этих препаратов, блокирующих рецепторы ЭТ-1, приводит к существенному повышению физической активности пациентов, уменьшению выраженности клинических симптомов, замедлению темпов прогрессирования заболевания и повышению выживаемости пациентов с ИЛГ [9—11].

Наряду с изучением клинической эффективности важным представляется также исследование влияния бозентана на состояние клеточного звена иммунной системы как возможного пускового механизма патологических процессов, ведущих к формированию ИЛГ.

Цель исследования — изучение влияния бозентана на клиническое состояние и гемодинамику, а также клеточное звено иммунитета у больных ИЛГ.

В одноцентровое сравнительное исследование включили 35 пациентов с ИЛГ, госпитализированных в Отдел системных гипертензий для уточнения диагноза и подбора лечения. Диагноз ИЛГ устанавливали по данным комплексного клинико-инструментального обследования: рентгенографии органов грудной клетки, трансторакальной эхокардиографии (ЭхоКГ) и при необходимости — чреспищеводной ЭхоКГ, оценки функции внешнего дыхания, перфузионной сцинтиграфии легких, мультиспиральной компьютерной томографии легких, катетеризации правых отделов сердца (КПОС). Для оценки клинического состояния больных определяли функциональный класс (ФК) в соответствии с классификацией ВОЗ, проводили пробу с 6-минутной ходьбой (П6-МХ) с оценкой индекса одышки по Боргу, определяли систолическое давление в легочной артерии (СДЛА) и ДЛА_ср., ЛСС, ДЗЛА, сердечный индекс (СИ) и насыщение кислородом артериальной крови (SaO₂).

Критериями включения пациентов были возраст старше 18 лет, наличие ИЛГ, ФК II—IV, стабильное течение заболевания на фоне проводившейся в течение предшествовавших 3 мес терапии, расстояние, пройденное в П6-МХ >50 и <450 м, использование контрацептивов женщинами детородного возраста, письменное информированное согласие на включение в исследование.

Критерии невключения: возраст моложе 18 лет, ЛГ установленной этиологии, другие формы ЛГ; наличие рецидивирующей тромбоэмболии легочной артерии, тромбозов легочной артерии (ЛА); беременность; лактация; хроническая обструктивная болезнь легких; рестриктивные заболевания легких; системная артериальная гипотония; заболевания опорно-двигательного аппарата, препятствующие проведению П6-МХ; наличие системных признаков воспаления; ИБС; уровень креатинина в сыворотке крови >125 ммоль/л; анемия; тяжелые нарушения функции печени; изменения проводимой по поводу ЛГ терапии в течение предшествующих 3 мес наблюдения (варфарин, диуретики, сердечные гликозиды, антагонисты кальция); включение в другое клиническое исследование.

Пациенты, включенные в исследование, во время госпитализации начинали получать бозентан в дозе 62,5 мг 2 раза в сутки (утренние и вечерние часы). После 4-недельного лечения и оценки его безопасности на основании клинических проявлений (нежелательные явления) и лабораторных анализов больных рандомизировали методом конвертов для приема бозентана в прежней дозе — 125 мг/сут (n=18) и по 250 мг/сут (n=17). При этом сохранялся двукратный в течение дня прием препарата. Общая продолжительность наблюдения каждого пациента в исследовании составляла 12 нед.

Всем больным исходно, после 3 и 12 нед лечения проводили иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови методом проточной цитофлюориметрии на аппарате Beckman Coulter FC 500 (США). Определяли уровни следующих CD-маркеров: CD3+, CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD3+CD(16+56), CD3–CD(16+56), CD19+, CD3+CD25+, CD50+, CD3+HLA-DR+, CD3–HLA-DR+, CD3+CD95+, СD4/СD8 (моноклональные антитела Beckman Coulter, США). Функциональную активность нейтрофилов оценивали по их способности поглощать частицы латекса. Определяли фагоцитарную активность нейтрофилов (ФАН); фагоцитарное число (ФЧ) и при стимуляции зимозаном — фагоцитарный резерв (ФР).

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакетов статистических программ Statistica 7.0 и SPSS 13.0. Для каждой из величин (в зависимости от их типа распределения) определяли среднее и стандартное отклонение или медиану и квартили распределения. При сравнении 2 групп больных по основным показателям клеточного иммунитета (в зависимости от типа распределения анализируемых показателей) использовали непарный критерий t Стьюдента или U-критерий Манна—Уитни. При проведении парных сравнений уровней клеточного звена иммунитета внутри групп в 1, 2 и 3-й точках применяли парный критерий Вилкоксона. Статистически значимыми считали различия при р<0,05. Гипотезу о нормальности распределения исследуемых показателей проверяли с использованием критерия Шапиро—Уилка.

На момент включения в исследование обе группы больных ИЛГ были сопоставимы по возрасту и полу, параметрам функционального и гемодинамического статуса (табл. 1).

Частота определения незначительно выраженного ограничения физической активности в 1-й и 2-й группах больных, как и указание на невозможность выполнения любой нагрузки без возникновения клинических симптомов (16,7 и 17,6% соответственно), тоже была сопоставима.

Среднее расстояние, пройденное при П6-МХ, между группами пациентов существенно не различалось (см. табл. 1). Хотя СДЛА по данным ЭхоКГ исходно оказалось несколько выше у больных 1-й группы (95,1 мм рт.ст.), чем у больных 2-й группы (85,2 мм рт.ст.), однако по данным манометрии при КПОС у больных 1-й и 2-й групп оно составляло 94,7 и 95,1 мм рт.ст. соответственно. У пациентов обеих групп отмечалось существенное повышение ЛСС до 1319,0 и 1356,0 дин·с·см^-5 и СИ до 2,5 и 1,8 л/мин/м² соответственно. При этом ДЗЛА оставалось в пределах нормы.

Все включенные в исследование больные ИЛГ завершили 12-недельное лечение без клинического ухудшения. Наоборот, лечение бозентаном вызвало существенную положительную динамику клинических и инструментальных показателей. В обеих группах по сравнению с исходными данными отмечалось увеличение расстояния, пройденного в П6-МХ (+46 и +53 м соответственно; р<0,05), существенно снизились ФК и индекс одышки по Боргу (табл. 2).

В течение 12 нед наблюдения у пациентов, получавших бозентан в дозе 125 мг/сут, побочных эффектов не отмечалось. В группе, получавших его по 250 мг/сут, возникновение головной боли отметили 2 (12%) больных, ее выраженность была незначительной и отмены или снижения дозы препарата не потребовалось. К 12-й неделе лечения повышение активности трансаминаз в крови в 1,5—2 раза отмечалось только у одного пациента, что не потребовало отмены препарата. Все пациенты, завершившие 12-недельный период лечения, получили рекомендацию продолжить терапию бозентаном на постоянной основе в прежней дозе под контролем лабораторных данных.

При исследовании клеточного звена иммунитета у больных ИЛГ проводили фенотипирование клеток лимфоцитарного пула и оценивали функциональную активность макрофагов. Исходные данные по фенотипированию лимфоцитов периферической крови существенно не различались между двумя группами больных ИЛГ. В объединенных данных групп отмечалось повышение содержания NKT-подобных лимфоцитов до 10,79±6,2% при норме 5,0±2,3%. Другие показатели фенотипирования лимфоцитов периферической крови у больных ИЛГ не превышали норму. В ходе корреляционного анализа не удалось выявить значимые взаимосвязи между параметрами, характеризующими клинико-функциональный и гемодинамический статусы больных, и содержанием клеток лимфоцитарного пула, а также показателями функциональной активности макрофагов, как исходно, так и на фоне лечения бозентаном.

Динамика показателей фенотипирования лимфоцитов периферической крови у пациентов с ИЛГ при лечении бозентаном в дозах 125 и 150 мг/сут представлена в табл. 3.

Повышенное исходно количество клеток CD3+ CD16+56+ (NKT-подобные лимфоциты) оставалось статистически достоверно выше нормы в течение всего периода наблюдения в обеих группах, за исключением 12-недельной точки у пациентов 1-й группы. В этой группе выявлена тенденция к повышению содержания лимфоцитов CD3+CD25+ к 12-й неделе лечения по сравнению с исходными величинами (p=0,051). Во 2-й группе к 3-й и 12-й неделям лечения обнаружено повышение по сравнению с нормой содержания лимфоцитов CD3+CD25+. При этом статистически значимых различий между двумя группами больных не отмечено.

В табл. 4

При оценке динамики клинического статуса больных ИЛГ на фоне лечения бозентаном следует обратить внимание на то, что у большинства из них в нашем исследовании имелся III и IV ФК (у 60% в 1-й группе и у 64% во 2-й группе), а это сопоставимо с составом больных ИЛГ^[1] в рандомизированных исследованиях — пилотном исследовании 351 [10] и BREATHE-1 (Bosentan Randomized Trial of Endothelin Antagonist Therapy) [11], в которые также включали больных с выраженным нарушением функционального статуса. У всех пациентов в первом исследовании констатирован III ФК, а во втором — III ФК и 10% IV ФК. После 12-недельного лечения бозентаном у наших больных отмечалось значительное улучшение функционального статуса. Увеличение расстояния, пройденного в П6-МХ, составило +46 м в 1-й группе больных и +53 м — во 2-й группе, что сопоставимо с аналогичными результатами исследования BREATHE-1, в котором среднее различие этого показателя между группами лечения (бозентан (+36 м) и плацебо (–8 м) составило 44 м (р<0,001). В результате 12-недельного лечения бозентаном нами выявлено статистически значимое снижение ФК, что также отмечено в результатах упомянутых выше исследований.

Как указано в нашей работе, применение бозентана приводит к статистически значимой положительной динамике ряда гемодинамических параметров (СДЛА, ЛСС и ДЛА_ср.), тенденции к повышению СИ, что согласуется с результатами исследования 351, в котором показано улучшение этих гемодинамических параметров, а также уровней ДПП и ДЗЛА [10].

У больных ИЛГ уже описаны значимые изменения клеточного иммунного статуса [5, 11, 12]. В частности, отмечено снижение числа Т-хелперов/индукторов, цитотоксических Т-лимфоцитов и лимфоцитов, несущих молекулу адгезии, а также увеличение содержания активированных лимфоцитов.

Мы не выявили снижения количества цитотоксических лимфоцитов CD8+ в периферической крови. При анализе Т-хелперного звена клеточного иммунитета наблюдалась тенденция к некоторому повышению количества лимфоцитов CD3+СD4+ к 12-й неделе лечения. Однако к 12-й неделе лечения в 1-й группе больных, а также к 3-й и 12-й неделе во 2-й группе статистически значимо повысилось количество Т-хелперов в периферической крови относительно референсных значений. Ранее в литературе [5] были описаны изменения количества одного из подтипов лимфоцитов CD3+СD4+ — регуляторных Т-лимфоцитов, несущих большое количество рецепторов CD25 и отличающихся наличием ядерного фактора FoxP3, который мы не определяли.

Мы выявили значимое увеличение количества клеток CD3+CD16+56+ практически как исходно, так и на фоне лечения бозентаном. Отсутствие превышения нормальных значений к 12-й неделе у пациентов 2-й группы объясняется, по-видимому, не влиянием препарата на количество этих клеток (динамика данного показателя не выявлена), а снижением значимости различий с референсными показателями в связи с анализом показателей клеточного иммунитета к 12-й неделе у 8 больных этой группы.

NKT-подобные лимфоциты, которые несут на своей поверхности маркеры CD3+CD16+56+, играют важную роль в иммунных реакциях, являясь важным элементом врожденного иммунного ответа. Эти клетки участвуют в противовирусной и противоопухолевой защите. Известна также их важная роль в формировании гранулематозного воспаления. Они могут также выполнять регуляторную роль, снижая активность аутоиммунного ответа. Эти особенности обусловлены свойством данных клеток, помимо цитотоксической функции, синтезировать большее количество как Th1-, так и Th2-цитокинов (в том числе значительные количества γ-интерферона — γ-ИФН) [13]. При этом ранее продемонстрировано, что применение бозентана снижает концентрацию провоспалительных цитокинов в периферической крови у больных с ИЛГ, в том числе у пациентов с ЛАГ, ассоциированной с системной склеродермией. В частности, у них выявлено снижение уровня γ-ИФН. Авторы предположили, что отмеченное ими на фоне приема бозентана снижение уровня интерлейкинов-2, -6, -8 и γ-ИФН ведет к замедлению прогрессирования фиброзных изменений и поражений сосудов [14]. В нашем исследовании мы не выявили изменения содержания клеток, являющихся одним из источников γ-ИФН.

Важно отметить, что у больных 2-й группы на фоне приема бозентана к 3-й и 12-й неделям лечения констатировано статистически значимое превышение по сравнению с нормой количества лимфоцитов CD3+CD25+. Это Т-лимфоциты, несущие на своей поверхности рецептор к интерлейкину-2 (легкую цепь). Данный фенотип в основном характерен для активированных Т-лимфоцитов. В 1-й группе пациентов выявлена лишь тенденция к повышению количества данных клеток к 12-й неделе лечения. Полученные различия необходимо трактовать с осторожностью, учитывая небольшое число пациентов в обеих группах, что повышает вероятность совершения статистической ошибки второго рода. Однако, учитывая, что на фоне лечения бозентаном у больных ИЛГ в обеих группах не снижалось содержание активированных Т-лимфоцитов, а также сохранялся повышенный уровень NKT-подобных лимфоцитов, можно предполагать, что, несмотря на применение препарата, у пациентов сохранялось персистирование воспалительного процесса.

В настоящей работе выявлена динамика не только Т-лимфоцитарного звена клеточного иммунитета, но и содержания В-лимфоцитов, причем отмечено статистически значимое различие между содержанием B-лимфоцитов (СD19+) в периферической крови между группами больных к 3-й и 12-й неделям лечения бозентаном. Ранее показано, что В-лимфоциты у пациентов с ИЛГ имеют провоспалительный статус, так как повышена регуляция генов, отвечающих за активацию клеток [3].

Ввиду неопределенного характера причинно-следственной связи между количеством, активностью клеток CD19+ и прогрессированием заболевания трактовка наблюдаемых нами различий между группами пациентов с ИЛГ, принимающих бозентан в различных дозах, затруднена. Обращает внимание однонаправленность изменений в течение первых 3 нед лечения, когда все больные получали бозентан в дозе 125 мг/сут. Так, у больных 2-й группы отмечалось статистически значимое снижение содержания лимфоцитов CD19+, у больных 1-й группы — тенденция к снижению содержания В-лимфоцитов. Это позволяет предположить, что действие бозентана прямо или опосредованно позитивно влияет на состояние В-лимфоцитарного звена иммунной системы при ИЛГ.

При анализе состояния фагоцитарного звена у больных ИЛГ в динамике можно сделать заключение о том, что бозентан не оказывает значительного влияния на эти показатели. Различия показателей ФЧ между группами, зафиксированные только к 3-й неделе лечения, не могут убедительно свидетельствовать о влиянии бозентана на функцию фагоцитоза.

Лечение неселективным АРЭ бозентаном в дозах 125 и 250 мг/сут приводит к статистически значимому улучшению клинического статуса больных ИЛГ (увеличению расстояния, пройденного в П6-МХ, снижению ФК, индекса одышки, СДЛА, ДЛА_ср. и ЛСС). Оно характеризуется хорошей переносимостью и не сопровождается клинически значимыми нежелательными явлениями.

Ограничением иммунологической части исследования является небольшое число пациентов, что объяснимо, если учитывать характер ИЛГ. Однако удалось выявить ряд особенностей. Исходно у больных ИЛГ отмечено статистически значимое повышение количества NKT-подобных лимфоцитов в периферической крови, которое не изменялось при назначении бозентана. В то же время показано, что бозентан прямо или опосредованно позитивно влияет на состояние В-лимфоцитарного звена иммунной системы у больных с ИЛГ.