Развитие судебно-биологической экспертизы в нашей стране идет по пути совершенствования традиционных методик и разработки высокочувствительных количественных методов исследования [1—12]. При производстве судебно-биологических экспертиз в государственных судебно-медицинских учреждениях РФ для установления групповых свойств пятен крови по системе АВ0 применяются реакция абсорбции-элюции (РАЭ) и количественная реакция абсорбции агглютининов (КРА) [13, 14]. Количественное соотношение двух базовых реакций — РАЭ и КРА, применяемых экспертами судебно-биологических подразделений для установления групповой принадлежности крови в пятнах на вещественных доказательствах, составляет 5:1 соответственно [15]. Существует мнение, что применение КРА, имеющей относительно низкую чувствительность, не является обязательным при выполнении судебно-медицинских экспертиз крови, но вместе с тем при производстве судебно-медицинских экспертиз выделений КРА может быть проведена для диагностики категории выделительства [16]. Преимущественное применение РАЭ объясняется следующими достоинствами: реакция позволяет исследовать пятна малой величины, дает возможность выявлять даже самые слабые антигены (при отсутствии влияния предмета-носителя), расширяет изосерологическую диагностику по антигенам других систем. Однако эта реакция является качественной и не позволяет судить о силе выявляемых антигенов, в связи с чем существует возможность получения ложноотрицательных результатов. Использование КРА позволяет судить о силе антигена по тому, на сколько ступеней поглощения снизился титр абсорбированной сыворотки крови. Вместе с тем у КРА имеются и недостатки, обусловленные необходимостью исследования относительно большого количества материала и низкой чувствительностью реакции. Необходимость применения КРА возникает: а) при выраженном влиянии предмета-носителя на диагностическую сыворотку (по результатам РАЭ), поскольку это влияние в реакции количественной абсорбции проявляется значительно меньше; б) для сравнения абсорбционной способности крови в исследуемом пятне и в образце, представленном для исследование; в) при наличии высокой вероятности возникновения блокады антител в фазе элюции, что приводит к ложноотрицательному результату РАЭ, т.е. к невыявлению антигена [17].

Необходимо отметить, что высокая вероятность возникновения блокады антител в фазе элюции, приводящего к ложноотрицательному результату РАЭ, является основным показанием для проведения КРА.

Количественную реакцию абсорбции можно проводить в общепринятых условиях, расходуя на опыт минимум 50 мг материала в экспертизах, в которых исследуемые объекты имеют значительные размеры. При изучении следов крови малой величины возникают сложности проведения КРА. Для того, чтобы соблюсти определенные количественные соотношения изучаемого материала и используемых реагентов предложено совместное проведение КРА и РАЭ в малом объеме исследуемого материала. Количественная реакция абсорбции-элюции (КРАЭ) была разработана доц. Г.М. Сулейменовой и доц. Ю.В. Зиминой в 1997 г. для изучения следов выделений в объектах малой величины с целью обеспечения дополнительной (кроме антигенной) характеристики выделения по категории выделительства его обладателя (секретор, несекретор) [18]. Принцип этой методики состоит в сочетании титрования абсорбированных в ходе РАЭ сывороток, использовании полученных результатов для учета степени абсорбции искомого антигена (КРА) с дальнейшим проведением обычной РАЭ. Указанные авторы выявили следующие преимущества КРАЭ: сокращение сроков исследования (в результате их одновременного проведения), экономию исследуемого материала и используемых реагентов.

Практический опыт экспертной деятельности свидетельствует о том, что при установлении антигенной принадлежности насыщенных образцов крови заведомо известных групп периодически возникает явление блокады антител в фазе элюции. Это явление обусловлено высокой абсорбционной способностью группового фактора и может послужить причиной необнаружения искомого свойства при учете реакции после фазы элюции. Для устранения явления блокады антител рекомендуется проведение пробы на истощение абсорбированной сыворотки (проверка одноименными тест-эритроцитами после фазы абсорбции). Однако истощение абсорбированный сыворотки не всегда происходит полностью, о чем свидетельствует значительно меньшая выраженность агглютинации тест-эритроцитов, чем в исходной неабсорбированной сыворотке. В этих случаях проверяют активность (титр) абсорбированной сыворотки путем ее кратного титрования. Показатель степени абсорбции в 3—5 ступеней поглощения является достаточным для диагностики присутствия искомого антигена.

Предположив возможность явления блокады и в достаточно насыщенных пятнах крови на вещественных доказательствах, было сочтено целесообразным применять КРАЭ во всех необходимых случаях, когда отрицательный результат учета фазы элюции может оказаться ложным в связи с присутствием антигена достаточной силы, чтобы вызвать феномен блокады.

Предварительное апробирование метода КРАЭ на 32 образцах крови заведомо известных групп, А, В, АВ, 0 (как со слабо, так и сильно выраженным групповым фактором), позволило убедиться в его эффективности независимо от специфичности определяемого группового фактора. В образцах крови, содержащих сильный антиген, отрицательный результат реакции после учета фазы элюции отвергали при количественном учете фазы абсорбции, т.к. снижение титра абсорбированной сыворотки на 4—6 ступеней поглощения позволяло сделать вывод о выявлении искомого антигена. В отличие от этого, при изучении образца со слабо выраженным фактором, невыявление группового свойства РАЭ нередко сочеталось с отсутствием снижения титра абсорбированной сыворотки при количественном учете фазы абсорбции. Совместный одновременный результат выполнения двух реакций указывал на необходимость изменения условий РАЭ с целью повышения ее чувствительности в пользу искомого антигена, т.е. проведение дополнительных исследований объекта с использованием диагностических реагентов другого типа и/или более чувствительных вариантов фазы элюции.

Принимая во внимание имеющиеся практические наблюдения, стали регулярно применять методику КРАЭ на экспертном материале параллельно с исследованием образцов крови, представленных для сравнения, и контрольных образцов крови известных групп во всех случаях невыявления группового свойства (отрицательный результат РАЭ). При этом фактически расширение исследования заключалось в титровании абсорбированного реагента, т.е. дополнительный опыт проводили с сывороткой, которая осталась после фазы абсорбции.

Иными словами, исследуя степень истощения, фактически уточняли результат РАЭ и, возвращаясь к начальному этапу — фазе абсорбции, осуществляли ее количественный учет, проводя одновременно две реакции — РАЭ и КРА, т.е. КРАЭ.

Цель работы заключалась в разработке варианта усовершенствованной комбинированной методики определения групповой принадлежности следов крови на вещественных доказательствах, позволяющего отличать ложноотрицательный результат РАЭ, обусловленный блокадой антител сыворотки сильным антигеном, от подлинного отсутствия антигена в пятне.

Материал и методы

Усовершенствованную методику КРАЭ отрабатывали на экспертном материале, параллельно с исследованием образцов крови проходящих по делу лиц и контрольных образцов крови известных групп во всех случаях необнаружения группового свойства (отрицательного результата РАЭ). При этом фактически расширение исследования заключалось в титровании абсорбированного реагента, т.е. дополнительный опыт проводили с сывороткой, оставшейся после фазы абсорбции. КРАЭ применяли на протяжении 5 лет при производстве 51 судебно-биологической экспертизы крови для всех объектов с отрицательным результатом РАЭ. Было исследовано 197 объектов, потребовавших применения количественного учета фазы абсорбции. Из них 60 исследованы изосыворотками, 78 — сыворотками с моноклональными антителами (МКАТ), а остальные 59 —двумя названными видами реагентов.

Ход исследования. Исследование проводили по следующей методике: заведомые образцы крови, материал пятна и предмета-носителя (2—4 нити длиной 1,0 см) не фиксировали, заливали стандартными реагентами анти-А и анти-В двух типов: изосыворотками и моноклональными антителами (МКАТ) в титре 1:64—128 (макроучет и микроучет соответственно). Фазы абсорбции и элюции осуществляли при обычных условиях: абсорбция 24 ч при температуре +4—6 °C, отмывание от неабсорбированных антител 4—5-кратное, фаза элюции — в физраствор при температуре 56 °C в течение 25 мин. Проводили макро- и микроскопический учет: микроскопический — после добавления эритроцитов и центрифугирования, макроскопический — после титрования в планшетках.

После учета результатов элюции в случае необнаружения искомого антигена (возможно блокированного) переходили к этапу учета степени абсорбции — титрованию в кратных разведениях абсорбированной сыворотки. Результаты реакции учитывали путем сравнения титра исходной и абсорбированной сыворотки. Снижение титра абсорбированной сыворотки не менее чем на 3—4 ступени поглощения по сравнению с таковым при исследовании контрольного участка предмета-носителя свидетельствовало об обнаружении в объекте антигена достаточной силы, способного вызвать блокаду антител в фазе элюции. Отсутствие снижения титра сыворотки, абсорбированной объектом, свидетельствовало о том, что в данном объекте невыявление антигена после фазы элюции действительно является его истинным отсутствием. Снижение титра не более чем на 2 ступени, влияние предмета-носителя на реагенты — такие нечеткие результаты являлись показанием для дальнейшего продолжения исследования объекта. При влиянии предмета-носителя проводили повторные опыты, применяя те же реагенты с более высоким титром, а также перевод объекта на марлю. Поскольку при слабой насыщенности объектов явление блокады антител практически исключено, проводить количественный учет абсорбции необязательно, поэтому при отрицательном результате РАЭ с ненасыщенными объектами использовали более чувствительный вариант элюции — взвесь эритроцитов, меняли соотношение изучаемого материала и используемого реагента в пользу искомого антигена, удваивая количество исследуемого материала.

В результате применения КРАЭ было установлено, что блокада антител сильным антигеном чаще возникала с изогемагглютинирующими реагентами, даже в пятнах средней насыщенности. В связи с этим при неудовлетворительных результатах исследования (обеих фаз КРАЭ) проводили повторные опыты КРАЭ с реагентами, не использованными ранее (например, с МКАТ, если первично применяли изосыворотки). В таких случаях антиген, который в большинстве опытов в фазе элюции блокировал антитела изосывороток, не вызывал блокады моноклональных антител. При этом оказалось допустимым использовать МКАТ в более высоком титре, чем 1:128 (под контролем опыта с гетерологичным антигеном).

Результаты

Метод КРАЭ отрабатывали на экспертном материале, параллельно с исследованием образцов крови проходящих по делу лиц и контрольных образцов крови известных групп во всех случаях невыявления группового свойства (отрицательного результата РАЭ). При этом фактически расширение исследования заключалось в титровании абсорбированного реагента, т.е. дополнительный опыт проводили с сывороткой крови, оставшейся после фазы абсорбции.

Проведенные исследования показали высокую эффективность применения КРАЭ для определения групповой принадлежности следов крови: из 197 изученных объектов с отрицательным результатом РАЭ в 128 было установлено присутствие антигена с помощью количественного учета фазы абсорбции, а в остальных 69 объектах подтвержден отрицательный итог РАЭ — отсутствие группового фактора.

Применение КРАЭ при производстве судебно-медицинской экспертизы крови оправданно в тех случаях, когда отрицательный результат учета фазы элюции может оказаться ложным в связи с присутствием антигена достаточной силы, чтобы вызвать феномен блокады антител, а также в тех случаях, когда образцы проходящих по делу лиц не представлены для исследования.

Заключение

КРАЭ является взаимодополняющим сочетанием двух иммунологических реакций и, вместе с тем, необходимым техническим и тактическим приемом, обеспечивающим решение трудной экспертной задачи: выявление антигена при феномене блокады антител или достоверное подтверждение их отсутствия в случае отрицательного результата РАЭ.

Усовершенствование общепринятой экспертной тактики фактически сводится к малообъемному дополнительному опыту — учету результата фазы абсорбции РАЭ путем установления титра абсорбированного реагента, что трансформирует РАЭ в две совместно проведенные иммунологические реакции — КРА и РАЭ, обозначаемые как КРАЭ.

Предложенный усовершенствованный вариант КРАЭ для определения групповых факторов в пятнах крови создает условия для взаимопроверяемости результатов двух иммунологических реакций — КРА и РАЭ, а именно позволяет контролировать отрицательный итог РАЭ и отличать ложный вариант необнаружения группового свойства, обусловленный блокадой антител сильным антигеном, от истинного его отсутствия.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.