Определение 2,4-диметилгидроксибензола хроматографическими методами при химико-токсикологическом исследовании биологического материала

Среди кислотных ядов, являющихся причиной острых отравлений с летальным исходом, важное место занимают ксиленолы, в частности 2,4-ксиленол, или 2,4-диметилгидроксибензол (2,4-ДМГОБ), смертельная доза которого для человека составляет 450—660 мг/кг [1—3]. Полулетальная доза (в мг/кг) 2,4-ДМГОБ для лабораторных крыс при введении per os равна 3200, перкутанно — 1040, для лабораторных мышей при введении per os — 809, интраперитонеально — 183 [4—8]. 2,4-ДМГОБ, как и его изомеры, входит в число экологически значимых токсикантов [9—13].

Судебно-химическое значение этого вещества определяется не только выраженной токсичностью в отношении теплокровных, но и широким спектром его применения. Так, 2,4-ДМГОБ используется в органическом синтезе, является компонентом эфирных масел, известен как антиоксидант и антисептик [14—17]. В сельскохозяйственной практике и медицине это вещество имеет перспективы использования в качестве фунгицидного средства [18, 19].

К физическим характеристикам 2,4-ДМГОБ относятся: температура кипения для жидкой (211,5 °C) и плавления для твердой (27—28 °C) форм субстанции; своеобразный запах; ограниченная (0,5375 г в 100 г) способность растворяться в воде; растворимость в этилацетате, хлороформе, диэтиловом эфире, низших спиртах, разбавленных растворах щелочей [6, 16].

Сведения, касающиеся вопросов изолирования 2,4-ДМГОБ из трупного материала, его очистки и определения в извлечениях из разных биоматриц, достаточно ограниченны [5, 16, 20].

Цель настоящего исследования — разработка методики хроматографического определения 2,4-ДМГОБ в биологическом материале (ткани печени).

Исследования проводили с содержащим 98% основного вещества стандартом 2,4-диметилгидроксибензола (2,4-ДМГОБ), произведенным компанией Aldrich (США).

Приготовление модельных смесей биоматрицы (ткань печени) с 2,4-ДМГОБ и извлечение из них аналита изолирующим агентом (диметилкетон—этилацетат, 3:7) проводили в условиях, описанных в предыдущих публикациях [21—24].

На первом этапе очистки 2,4-ДМГОБ, выделяемого из биоматериала, от сопутствующих компонентов биоматрицы применяли экстракцию, используя особенности распределения соединения между водным и органическим слоями в зависимости от нахождения его в кислотной (молекулярной) или ионизированной формах.

При моделировании условий дополнительной очистки 2,4-ДМГОБ методом колоночной хроматографии обычного давления изучали особенности его хроматографического поведения в полупрепаративной колонке сорбента «Силасорб С-18» 30 мкм размером 150×10 мм. В качестве подвижных фаз при этом были испытаны гидрофильные жидкие органические вещества (ацетонитрил, диметилкетон, диоксан) и их бинарные композиции с водой. Каждый раз аналит вводили в сорбент в виде 2 мл 0,5% раствора в элюенте. Элюат собирали фракциями по 2 мл каждая. 2,4-ДМГОБ обнаруживали во фракциях методом спектрофотометрии, разбавляя каждую этанолом в 20—100 раз.

Изучали хроматографическую активность рассматриваемого диметилгидроксибензола и ряда других полиалкилгидроксибензолов близкой структуры в тонком слое силикагеля на аналитических пластинах «Сорбфил» с подложкой из алюминия и УФ-индикатором. Среди возможных подвижных фаз были рассмотрены пентан, три- и тетрахлорпроизводные метана, диоксан, этилацетат и их бинарные композиции.

Проводили изучение хроматографической подвижности 2,4-ДМГОБ методом газовой хроматографии — масс-спектрометрии (ГХ-МС) (капиллярная колонка; химически неактивный газ-носитель) и характера масс-спектра аналита, применяя прибор Agilent Technologies 6850 (Agilent Technologies, США) с МС-детектором 5973, ионизируя электронным ударом (70 эВ) и регистрируя сигнал по полному ионному току.

Исследовали хроматографическую подвижность 2,4-ДМГОБ (метод высокоэффективной жидкостной хроматографии, ВЭЖХ) в аналитической колонке сорбента с привитой фазой С18, используя хроматограф LC-20 Prominance (Shimadzu, Япония) с матричным фотодиодным детектором SPD-M20A (аналитическая длина волны 280 нм).

При моделировании процесса очистки аналита методом экстракции установлено, что оптимальные условия для его выделения из водной среды в неионизированном виде достигаются при pH водного слоя 1,5—8,5, при использовании диэтилового эфира как гидрофобного экстрагента и хлорида калия в качестве высаливателя. Для перевода аналита из органического слоя в водный слой в форме 2,4-диметилфенолята (ионизированная форма) наилучшим условием является использование в качестве органической среды смеси гексан—диэтиловый эфир (1:1) и буферного раствора с pH 12—13 в качестве экстрагента.

Результаты изучения характера хроматографической активности 2,4-ДМГОБ в полупрепаративной колонке сорбента с привитыми радикалами С18 отражены в табл. 1. Данные таблицы показывают, что оптимальными элюентами можно считать полярные смеси ацетонитрил—вода (7:3) (P′=7,12), диоксан—вода (6:4) (P′=6,96) и диметилкетон—вода (7:3) (P′=6,63). Из числа этих подвижных фаз в дальнейшем для элюирования 2,4-ДМГОБ в колонке сорбента «Силасорб» С-18 применяли смесь ацетонитрил—вода (7:3). При этом аналит вымывался в составе фракций элюата 4—8 (7—16 мл).

Таблица 1. Параметры хроматографирования 2,4-диметилгидроксибензола в полупрепаративной (150×10 мм) колонке сорбента «Силасорб» С-18 30 мкм

Примечание. Pʹ — полярность элюента; V_R — объем удерживания; kʹ — коэффициент емкости; N — число теоретических тарелок; H — высота, эквивалентная теоретической тарелке.

Данные, полученные по результатам исследования хроматографической подвижности 2,4-ДМГОБ и ряда других полиалкилфенолов в тонком слое силикагеля при использовании отдельных мало- и среднеполярных элюентов, приведены в табл. 2.

Таблица 2. Особенности хроматографической подвижности 2,4- диметилгидроксибензола и ряда других полиалкилгидроксибензолов на пластинах «Сорбфил» (тонкий слой сликагеля СТХ-1А) с использованием оптимальных элюентов

Примечание. Rf — абсолютная подвижность; Rs — относительная подвижность; B — условное удерживание; kʹ — коэффициент емкости; N — число теоретических тарелок; H — высота, эквивалентная теоретической тарелке.

Как можно заключить на основе данных таблицы, оптимальной подвижной фазой является система тетрахлорметан—диоксан (9,5:0,5).

При воспроизведении метода ГХ-МС в качестве жидкой неподвижной фазы было предложено использование (5%-фенил)-метилполисилоксана, нанесенного в виде тонкого слоя (0,32 мкм) на внутреннюю поверхность колонки типа DB-5MS EVIDEX (25000×0,2 мм), в качестве подвижной фазы — гелия, пропускаемого со скоростью 0,6 мл/мин. Вводя пробу (0,004 мл), поток делили в отношении 1:2. Создаваемая начальная температура колонки поддерживалась на уровне 70 °C в течение 3 мин. Температура инжектора была равна 250 °C, а интерфейса детектора — 300 °C. 2,4-ДМГОБ определяли в форме соответствующего триметилсилильного производного (силилируюший агент — N-триметилсилил-N-метилтрифторацетамид (MSTFA)). Процесс взаимодействия аналита с MSTFA продолжался в течение получаса в среде дихлорметана при 60 °C.

Полученная в предложенных условиях газо-жидкостная хроматограмма триметилсилильного деривата 2,4-ДМГОБ-стандарта и его масс-спектр приведены на рис. 1.

Рис.1. Хроматограмма (метод ГХ-МС) (а) и масс-спектр (б) триметилсилильного деривата стандарта 2,4- диметилгидроксибензола.

Как видно из рис. 1, производное 2,4-ДМГОБ удерживается в колонке хроматографа в течение 8,57±0,03 мин. Число теоретических тарелок составило 349 688. В масс-спектре деривата отмечается присутствие группы характерных заряженных частиц (m/z): 45; 59; 73; 82; 91; 105; 119; 135; 149; 163; 179; 194. По уровню интенсивности среди них выделяются сигналы частиц с массами (m/z) 105; 179 и 194 (молекулярный ион).

Для достижения высоких хроматографических характеристик при определении методом ВЭЖХ с использованием сорбента, имеющего привитые алкильные радикалы, была применена колонка Discovery C-18 250×4,6 мм с предваряющей колонкой 20×4,0 мм. Аналит элюировали бинарной смесью ацетатный буферный раствор с pH 5,5 — ацетонитрил (50:50) со скоростью 1000 мкл/мин в условиях термостатирования колонки при 40 °C. В данных условиях время удерживания 2,4-ДМГОБ составляло 5,85 мин, число теоретических тарелок — 6700.

Изолирование. 25 г измельченной (дисперсность 0,2—0,4 см) биоматрицы (ткани органа) подвергают настаиванию в режиме периодического перемешивания со смесью диметилкетон—этилацетат (3:7) (50 г × 2; продолжительность отдельного настаивания 30 мин). Жидкое извлечение фильтруют через Na₂SO₄ безводный, сформированный в виде слоя высотой 1,5—2,0 см в стеклянном фильтре диаметром 4 см, после чего промывают фильтр 20 г смеси диметилкетон—этилацетат (3:7). Фильтраты соединяют и упаривают до 0,5—1,0 мл в токе воздуха комнатной температуры, а затем полностью испаряют растворители в токе азота.

Очистка. После стадии испарения в токе азота остаток обрабатывают 5 мл диэтилового эфира, раствор разбавляют 5 мл гексана и встряхивают 4 мин (частота 30 встряхиваний в мин) с 10 мл щелочного раствора pH 12,0—13,0, переводя аналит в ионизированной форме в водно-щелочную фазу.

Экстрагирование щелочным раствором повторяют, экстракты объединяют. Водно-щелочное извлечение подкисляют до pH 2—3 24% раствором HCl, переводя аналит в молекулярную форму, насыщают Na₂SO₄, затем дважды (20 мл × 2) экстрагируют диэтиловым эфиром. Эфирный экстракт пропускают через слой безводного Na₂SO₄ высотой 1,5—2,0 см и диаметром 4 см, находящийся в стеклянном фильтре, и промывают слой Na₂SO₄ 20 мл диэтилового эфира. Фильтраты объединяют, упаривают в токе воздуха до 0,5—1,0 мл, а потом в токе азота до удаления растворителя.

После удаления растворителя остаток обрабатывают 2,1 мл ацетонитрила, раствор разбавляют 0,9 мл воды, после чего смесь вводят в колонку (200×10 мм) сорбента «Силасорб» C-18 30 мкм. Элюируют системой ацетонитрил—вода (7:3). Часть истекающего элюата (фракции с 4-й по 8-ю, объем каждой 2 мл) испаряют в выпарительной чашке сначала в токе воздуха до 0,5—1,0 мл и далее — в токе азота до удаления растворителей. Остаток подвергают растворению в 10 мл диметилкетона, получая раствор для исследования. Из этого раствора в выпарительные чашки (А, Б и В) помещают соответственно 0,1—2,5, 4 и 2,5 мл и испаряют растворитель.

Определение методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). Сухой остаток из выпарительной чашки А растворяют в 0,2—0,3 мл дихлорметана и помещают на стартовую линию пластины «Сорбфил» с УФ-индикатором. Проводят определение, элюируя смесью тетрахлорметан—диоксан (9,5:0,5). Детекцию хроматограмм осуществляют посредством облучения их УФ-светом (λ=254 нм). Критерием идентификации аналита является значение Rf, совпадающее с Rf 2,4-ДМГОБ-стандарта (0,62±0,03).

Определение методом ГХ-МС. Сухой остаток из выпарительной чашки Б растворяют в 5 мл дихлорметана. 0,1 мл раствора вносят в пробирку вместимостью 0,2 мл, обрабатывают 0,02 мл N-триметилсилил-N-метилтрифторацетамида 0,5 часа при 60 °C. Смесь охлаждают и доводят в мерной колбе до 5 мл дихлорметаном. Далее 4 мкл полученного раствора триметилсилильного производного 2,4-ДМГОБ вводят в испаритель, деля поток в отношении 1:2. Определение осуществляют в соответствии с приводимыми выше условиями. Идентифицируют 2,4-ДМГОБ, принимая во внимание время удерживания триметилсилильного деривата и набор сигналов заряженных частиц в его масс-спектре.

На рис. 2 изображены газо-жидкостная хроматограмма и масс-спектр триметилсилильного деривата 2,4-ДМГОБ, выделенного из биоматериала (ткани печени) и подвергнутого очистке по предложенной схеме. Согласно экспериментальным данным, совпадение масс-спектров триметилсилильного деривата 2,4-ДМГОБ и стандарта этого деривата составляет более 86%.

Рис. 2. Хроматограмма (метод ГХ-МС) (а) и масс-спектр (б) триметилсилильного деривата 2,4-диметилгидроксибензола, выделенного из биоматериала (ткани печени) и подвергнутого очистке.

Определение методом ВЭЖХ. Сухой остаток из выпарительной чашки В обрабатывают 5 мл ацетонитрила, осуществляя растворение, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводят жидкое содержимое колбы до указанного объема ацетатным буферным раствором с pH 5,5. Затем 20 мкл содержимого колбы отбирают для определения, которое проводят в приведенных выше условиях, элюируя бинарной смесью ацетатный буферный раствор с pH 5,5 — ацетонитрил (50:50).

Изображения хроматограмм 2,4-ДМГОБ-стандарта и 2,4-ДМГОБ, извлеченного из биоматериала (ткани печени) и очищенного по предложенной схеме, представлены на рис. 3.

Рис. 3. Хроматограммы (метод ВЭЖХ) 2,4-диметилгидроксибензола-стандарта (а) и 2,4-диметилгидроксибензола, извлеченного из биоматериала (ткани печени) (б) и подвергнутого очистке.

Идентифицируют 2,4-ДМГОБ по времени его удерживания в колонке. Количественное определение аналита осуществляют по площади пика, проводя расчеты с использованием градуировочного графика.

Согласно нормативным требованиям, принятым в области судебнохимического анализа, разработанную методику валидировали по представленным ниже основным критериям [25].

Линейность. Линейная зависимость между количеством 2,4-ДМГОБ в единице массы биоматрицы (ткань печени) (C, мкг/г) и площадью пика (S, усл.ед.) на хроматограмме (ВЭЖХ) наблюдается в области концентраций 1,2—2000 мкг/г и описывается уравнением регрессии S=8598∙C-108 с коэффициентом корреляции (r) 0,99879. Отклонения экспериментально найденного содержания аналита в градуировочных смесях с биоматериалом от номинальной концентрации в них 2,4-ДМГОБ составляют для смеси с наименьшей концентрацией 17,33% (при норме ≤20%), для остальных смесей — от −5,45 до 12,85% (при норме ≤15%).

Селективность. Подвергали исследованию по 6 контрольных порций биоматрицы и биоматрицы, содержащей 2,4-ДМГОБ-стандарт в концентрациях 4—2000 мкг/г. Контрольным порциям биоматрицы соответствовали хроматограммы, на которых отсутствовали пики с временем удерживания, равным таковому аналита или близким к нему.

Правильность, прецизионность. Исследовали по 3 порции биоматрицы, содержащей 2,4-ДМГОБ-стандарт в концентрациях, соответствующих нижнему, среднему и верхнему уровням рабочего диапазона методики.

Полученные в результате пробоподготовки растворы по 5 раз хроматографировали. Определения проводили в первый и последующий дни. Результаты подвергали статистической обработке. Метрологические характеристики представлены в табл. 3.

Таблица 3. Результаты оценки правильности и прецизионности методики определения 2,4-диметилгидроксибензола в биологическом материале (ткань печени) методом ВЭЖХ

Минимальное обнаруживаемое количество 2,4-ДМГОБ (предел обнаружения) в биоматрице составило 0,5 мкг/г. Минимальное определяемое количество 2,4-ДМГОБ (предел количественного определения) — 1,2 мкг/г.

Стабильность. Находили значения площади пика аналита в процессе хроматографирования его стандартного раствора, выдерживаемого 14 сут при 2—4 °C. Доказательство кратковременной стабильности приготовленных проб, выдерживаемых сутки, осуществляли, определяя площади пиков через 24 ч. Определение выполняли при содержании 2,4-ДМГОБ, соответствующем начальной и конечной концентрации рабочего диапазона линейного интервала. Колебания площадей пиков не выходило за пределы требуемого значения правильности.

Извлечение объекта исследования из биоматериала проводили смесью органических растворителей диметилкетон—этилацетат (3:7), настаивая дважды по полчаса при условии двойного превосходства массы изолирующей жидкости над массой биоматрицы.

Для достижения достаточной степени очистки извлеченного 2,4- ДМГОБ применяли жидкость-жидкостную экстракцию в совокупности с хроматографией в полупрепаративной колонке сорбента «Силасорб С-18» 30 мкм (элюент — ацетонитрил—вода в соотношении 7:3). После очистки извлеченного аналита его идентифицировали, используя методы хроматографии (ТСХ, ГХ-МС и ВЭЖХ). Для оценки количественного содержания 2,4-ДМГОБ применяли ВЭЖХ. Предел обнаружения аналита в биоматрице составил 0,5 мкг/г, предел количественного определения — 1,2 мкг/г.

Выполнены валидационные мероприятия в отношении методики определения 2,4-ДМГОБ в биоматериале (ткань печени), обосновано ее соответствие показателям линейности, селективности, правильности, прецизионности и устойчивости.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.