Development of a carbamazepine determination method based on high-performance liquid chromatography with diode array

Khabieva N.A.; Lyust E.N.; Timerzyanov M.I.

doi:https://doi.org/10.17116/sudmed20246701125

Введение

Карбамазепин является распространенным противосудорожным препаратом, который используют в качестве препарата первой линии для лечения парциальных судорог и невралгии тройничного нерва. Из-за своих фармакологических свойств карбамазепин при передозировке может представлять опасность для жизни человека [1—3].

В соответствии с Приказом Минтруда России №52н, Минздрава России №35н от 31.01.19 «Об утверждении перечня медицинских обследований, необходимых для получения клинико-функциональных данных в зависимости от заболевания в целях проведения медико-социальной экспертизы» существует требование проведения исследования концентрации противоэпилептических препаратов в плазме крови (давностью не более 3 мес с даты проведения терапии) при необходимости уточнения эффективности терапии противоэпилептическими лекарственными препаратами (пункт 3.2.1). Следует добавить, что этот вопрос также важен и в судебно-медицинской практике для установления причинно-следственных связей наступления смерти.

Основным методом количественного определения наркотических, лекарственных, психотропных веществ, биологически активных соединений при производстве судебно-химических экспертиз, фармакокинетических и других исследованиях является метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с разными вариантами детектирования (спектрофотометрическим, флуориметрическим, электрохимическим, масс-спектрометрическим) [4—7]. Метод характеризуется высокой чувствительностью, позволяющей работать с низкими концентрациями веществ, специфичностью, возможностью анализа термолабильных аналитов. В ряде литературных источников приведены методики определения карбамазепина методом ВЭЖХ [8—10], нами предложены более универсальные условия определения аналита на более доступном аналитическом оборудовании.

Цель исследования — разработка методики определения карбамазепина на основе ВЭЖХ с диодно-матричным детектированием.

Материал и методы

Проведены исследования по выбору оптимальных условий определения карбамазепина методом обращено-фазной ВЭЖХ с помощью жидкостного хроматографа Agilent Technologies 1200. В режиме изократического элюирования использовали хроматографическую колонку ZORBAX SB-C18 (4,6×250 мм×5 мкм), стандартный раствор карбамазепина в концентрации 100 мкг/мл (концентрация выбрана с учетом обнаруживаемого в биологических образцах уровня карбамазепина при отравлениях [11]).

Выбор состава и соотношения компонентов подвижной фазы проводили с использованием воды, ацетонитрила и различных модификаторов в форме кислот и солей.

Для исключения асимметрии хроматографического пика, связанного как с распределительным механизмом, так и с дополнительным взаимодействием соединения с неподвижной фазой, необходимо было перевести соединение либо в молекулярную, либо в ионизированную форму. Для определения ионизированной формы карбамазепина применяли «кислые» элюенты. В качестве водной составляющей подвижных фаз были апробированы растворы кислот (фосфорной, трифторуксусной) и фосфатный буферный раствор с pH 3. Содержание ацетонитрила в элюенте составляло 35 и 40%.

Результаты

Установлено, что при соотношении подвижной фазы вода-ацетонитрил 70:30 время удерживания карбамазепина составило 11,8 мин. Увеличение концентрации ацетонитрила в составе подвижной фазы до 35% уменьшило время удерживания карбамазепина до 8,6 мин. При увеличении содержания ацетонитрила в подвижной фазе до 40% время удерживания карбамазепина составило 6,6 мин.

При 35% содержании ацетонитрила в подвижных фазах время удерживания карбамазепина варьировало в интервале 8,9—9,0 мин, симметричность пика составляла 0,63—0,65. Фактор асимметрии (Т_0,0₅ или А_0,05) согласно нормативной документации допускается от 0,8 до 1,5, в некоторых источниках от 0,75 до 2,5 [12, 13].

При использовании 40% содержания ацетонитрила в вышеуказанных подвижных фазах с растворами кислот время удерживания карбамазепина варьировало в интервале 6,6—6,7 мин, симметричность пика составляла 0,63—0,65. Наилучшие результаты с точки зрения времени удерживания вещества (6,1 мин) и симметрии хроматографического пика (0,87) наблюдали при использовании элюента: фосфатный буферный раствор (pH 3) — ацетонитрил (60:40).

В результате проведенных исследований предложены следующие условия хроматографического определения карбамазепина методом ВЭЖХ с использованием диодно-матричного детектора:

— хроматографическая колонка: ZORBAX SB-С18 (4,6×250 мм×5 мкм);

— подвижная фаза (A—B): фосфатный буферный раствор (pH 3) — ацетонитрил (60:40);

— режим элюирования: изократический;

— скорость потока подвижной фазы: 1,0 мл/мин;

— температура термостата колонки: 40 °C;

— время удерживания карбамазепина: 6,1 мин.

Для доказательства устойчивости (робастности) предложенных условий было изучено влияние ряда контролируемых изменений хроматографических условий на получаемые результаты. Исследования по установлению робастности проводили с учетом следующих факторов: соотношение компонентов подвижной фазы, скорость потока элюента, pH фосфатного буферного раствора, температура термостата колонки (Т1 – 38 °C, Т2 – 42 °C).

В изменяемых условиях результаты исследования робастности выражали в виде относительного стандартного отклонения хроматографических параметров времен удерживания (табл. 1) и площадей хроматографических пиков (табл. 2) и сравнивали с аналогичными результатами, полученными в начальных (неизмененных) хроматографических условиях (скорость потока подвижной фазы 1,0 мл/мин, состав элюента (A—B) 60—40, pH буферного раствора 3,0, температура колонки 40 °C.

Таблица 1. Исследования робастности методики определения карбамазепина по времени удерживания, мин

Время удерживания
Скорость потока, мл/мин		Состав элюента (A—B)		pH буферного раствора		Температура термостата колонки
0,9	1,1	62:38	58:42	2,8	3,2	T1	T2
6,775	5,551	7,214	5,357	6,070	6,138	6,161	6,061
6,777	5,552	7,213	5,358	6,069	6,136	6,161	6,062
6,776	5,556	7,214	5,358	6,070	6,139	6,161	6,061
6,773	5,557	7,215	5,359	6,070	6,140	6,163	6,061
6,771	5,557	7,215	5,361	6,071	6,142	6,163	6,061
6,765	5,557	7,215	5,362	6,070	6,145	6,163	6,062
Относительное стандартное отклонение, %:
0,065	0,049	0,011	0,036	0,010	0,051	0,018	0,0085

Таблица 2. Исследования робастности методики определения карбамазепина по площади хроматографического пика

Площадь хроматографического пика
Скорость потока, мл/мин		Состав элюента (A—B)		pH буферного раствора		Температура термостата колонки
0,9	1,1	62:38	58:42	2,8	3,2	T1	T2
2599	2666	2815	2879	2767	2943	2801	2825
2584	2661	2797	2874	2769	2945	2789	2827
2599	2664	2807	2897	2774	2946	2776	2808
2614	2678	2798	2899	2780	2959	2789	2810
2606	2681	2819	2899	2781	2965	2789	2823
2608	2680	2808	2897	2769	2965	2805	2814
Относительное стандартное отклонение, %:
0,39	0,33	0,31	0,39	0,22	0,35	0,37	0,29

В изменяемых условиях относительное стандартное отклонение времен удерживания и площадей хроматографических пиков карбамазепина не превышает 0,5%, что свидетельствует о хорошей устойчивости (робастности) разработанных условий анализа.

Выводы

1. Проведен выбор оптимальных условий определения карбамазепина методом обращено-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии в режиме изократического элюирования с использованием диодно-матричного детектора. Предложены следующие условия: хроматографическая колонка: ZORBAX SB-С18 (4,6×250 мм×5 мкм); подвижная фаза (A—B): фосфатный буферный раствор (pH 3) — ацетонитрил (60:40); скорость потока подвижной фазы: 1,0 мл/мин; температура термостата колонки: 40 °C.

2. В изменяемых условиях исследования (скорость потока элюента, его состав, pH буферного раствора, температура термостата колонки) доказана хорошая устойчивость (робастность) предложенных условий анализа карбамазепина, стандартное отклонение времен удерживания и площадей хроматографических пиков карбамазепина не превышало 0,5%.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Литература / References:

Кутлубаев М.А. Суицидальное поведение при неврологических заболеваниях: частота, предрасполагающие факторы, подходы к профилактике. Неврологический журнал. 2016;3:124-130.
Маслов О.Г., Брусин К.М., Новикова О.В. Особенности клиники и интенсивной терапии при острых отравлениях карбамазепином. Вестник уральской медицинской академической науки. 2010;1:31-33.
Пылаева О.А., Мухин К.Ю., Шатенштейн А.А. Эпилепсия и риск суицида (обзор литературы). Русский журнал детской неврологии. 2013;VIII(2):23-40.
Азарова И.Н., Барсегян С.С., Барам Г.И. Новые возможности высокоэффективной жидкостной хроматографии: базы данных ВЭЖХ-УФ. Хроматография на благо России. М.: Граница; 2007.
Яшин Я.И., Яшин А.Я. Вклад российских специалистов в развитие высокоэффективной жидкостной хроматографии. Журнал аналитической химии. 2020;10:885-897. https://doi.org/10.31857/S0044450220100163
Барсегян С.С., Кирюшин А.Н., Ерощенко Н.Н., Туаева Н.О., Носырев А.Е., Кирилюк А.А. Обнаружение 25B-NBOMe — производного фенилэтиламина в биологическом материале. Судебно-медицинская экспертиза. 2019;2:34-39. https://doi.org/10.17116/sudmed20196202134
Максимова Т.В., Плетенева Т.В., Саломатин Е.М., Козина Е.А., Барсегян С.С. Определение амитриптилина и его метаболита нортриптилина в биообъектах трупа методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Судебно-медицинская экспертиза. 2015;1:31-34. https://doi.org/10.17116/sudmed201558131-34
Ремезова И.П., Лазарян Д.С., Максименко Т.И., Санжиева Д.Ю., Рыбасова А.Ю. Разработка методик обнаружения некоторых атипичных нейролептиков для целей химико-токсикологического анализа. Фармация и фармакология. 2014;6(7):54-58.
Родина Т.А., Мельников Е.С., Соколов А.В., Прокофьев А.Б., Архипов В.В., Адамов Г.В., Поздняков Д.Л., Олефир Ю.В. Методика одновременного определения карбамазепина и карбамазепин-10,11-эпоксида методом ВЭЖХ-МС/МС. Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения. Регуляторные исследования и экспертиза лекарственных средств. 2015;4:20-25.
Родина Т.А., Мельников Е.С., Соколов А.В., Прокофьев А.Б., Архипов В.В., Аксенов А.А., Поздняков Д.Л. Экспресс-методика определения карбамазепина и карбамазепин-10,11-эпоксида методом ВЭЖХ-МС/МС. Химико-фармацевтический журнал. 2016;50(6):52-56.
Moffat AC, Osselton MD, Widdop B. Clarke’s Analysis of Drugs and Poisons [Electronic Edition]. London: Pharmaceutical Press; 2011.
ОФС.1.2.1.2.0001.15. Хроматография. Государственная Фармакопея РФ. 14-е изд. М.; 2018. Ссылка активна на 03.05.23. https://pharmacopeia.ru/gf-14-tom-1-863.pdf
Эпштейн Н.А. Оценка пригодности (валидация) ВЭЖХ методик в фармацевтическом анализе (обзор). Химико-фармацевтический журнал. 2004;38(4):40-56.
Receiver 29.06.2023