Хроматографический анализ твердых тканей зуба в целях определения возраста личности

Идентификация личности является актуальной проблемой в науке и практике судебной медицины. За последние десятилетия наблюдается неуклонный рост сообщений о геофизических, метеорологических и климатических катастрофах, гибели людей в результате военных конфликтов по всему миру, увеличении числа мигрантов [1, 2]. В современной литературе все чаще встречаются исследования, в которых отмечается важность оценки биологического возраста во время рутинной практики идентификации личности [3, 4]. К сегодняшнему дню для оценки возраста предложены десятки методов. Их можно разделить на три группы в зависимости от подхода: морфологические, рентгенологические и биохимические. В России судебные эксперты в основном используют морфологический подход: оценку остеогенеза, закрытия родничков, швов, стирания зубов, особенностей роста тела и т.д. Наиболее важным недостатком методов этой группы считается относительно низкая точность, особенно при обследовании пожилых людей. Биохимический подход при оценке возраста более применим для судебно-медицинских целей: результаты ряда исследований показали, что рацемизация аспарагиновой кислоты в костях и зубах коррелирует с биологическим возрастом человека [5—7]. Ткань зуба хорошо сохраняется, в ней происходит достаточное количество биохимических изменений в течение жизни. Однако к настоящему моменту количество опубликованных данных о применимости этого метода к российской популяции ограничено.

Цель исследования — оценка биохимических параметров аспарагиновой кислоты в зубах человека, которые могут быть внедрены в судебно-медицинскую практику в России.

Материалом исследования служили первые премоляры, которые были извлечены из трупов мужчин и женщин в возрасте от 16 до 76 лет. Перед вскрытием трупы содержались при температуре 3 °C, время смерти на момент вскрытия составляло не более 24 ч. Удаление зубов было произведено с информированного согласия следователя и в соответствии с законодательством Российской Федерации и Хельсинкской декларацией об этике. Критериями исключения из исследования являлись наличие кариеса и других возможных патологических процессов, сохранность зубов (были взяты только зубы с участками эмали и дентина в пригодном для исследования состоянии). Каждый зуб был запечатан в пластиковый пакет с присвоенным уникальным идентификационным номером и помещен на хранение в холодильник при температуре 3 °C.

С целью внедрения методики в судебно-медицинскую практику в случаях происшествий с большим количеством жертв процедура взятия образцов дентина была упрощена: был использован метод, предложенный P. Helfman и J. Bada [8]. Перед взятием пробы каждый зуб вручную очищали абразивами и погружали в раствор гипохлорита натрия на 1 ч для удаления с поверхности зуба остатков крови и мягких тканей. Затем зуб механически измельчали при комнатной температуре (20 °C) в агатовой ступке, а частицы дентина отбирали стерильными щипцами в ультрафиолетовом свете и дополнительно измельчали до получения порошкообразного вещества. Для каждого образца было взято 10 мг дентина. После гидролиза образца в 6 М растворе соляной кислоты при 37 °C в течение 6 ч проводили дериватизацию аминокислоты с помощью трифторуксусного ангидрида в метанольном растворе соляной кислоты (соотношение спирта и концентрированной кислоты 9:1).

Хроматографический анализ выполняли с помощью газового хроматографа (Agilent 6850) с использованием хиральной колонки (Agilent CP-Chirasil-20 beta 19091 GB233; 30 м×0,25 мм, 0,25 мкм) с 20% циклодекстриновой фазой в (35%-фенил)-метилполисилоксане и масс-селективного детектора (5973N, квадрупольного типа; температура квадруполя 150 °C; температура источника ионов 230 °C). Температура инжектора составляла 210 °C; впрыск осуществляли в режиме без разделения; газ-носитель — гелий; температура поверхности раздела составляла 230 °C; время задержки растворителя — 3 мин. Градиентное элюирование проводили при скорости потока 1,6 мл/мин; начальная температура колонки составляла 130 °C; время экспозиции — 1 мин; скорость нарастания — 0,5 °C/мин до 135 °C. Масс-детектор работал в режиме электронной ионизации. Диапазон сканирования 29—550 м/з.

Данные, полученные в результате хроматографического анализа, были обработаны с использованием программ Microsoft Excel и IBM SPSS Statistics 21. Применяли метод статистического анализа и параметрический статистический метод с последующим построением регрессионной модели определения возраста. Результаты сравнения были признаны статистически значимыми при p<0,05.

В общей сложности проанализировали 20 образцов дентина. Относительный квадрат пика D-аспарагиновой кислоты (DaspRPS) исследовали на предмет связи с возрастом. Содержание D-аспарагиновой кислоты в смеси рассчитывали с применением метода внутренней нормализации, при этом результаты отображали в относительных величинах, что упрощало расчет.

Вычисление производили по формуле:

DaspRPS = DaspPS∙100/∑S,

где DaspPS — абсолютная площадь пика исследуемого вещества на хроматограмме (D-формы производных аспарагиновой кислоты); ∑S — сумма абсолютных площадей всех пиков на хроматограмме.

Корреляционный анализ выполняли с целью установления связи между паспортным возрастом доноров, зубы которых использовали в настоящем исследовании, и относительным квадратом пика D-аспарагиновой кислоты (r=0,987). В процессе регрессионного анализа была разработана линейная модель оценки биологического возраста, которая описывается следующим уравнением:

DaspRPS = 0,088x + 3,345,

где DaspRPS — относительный квадрат пика D-аспарагиновой кислоты дентина зуба; x — биологический возраст человека (см. рисунок).

Точечный график, показывающий линейную корреляцию между биологическим возрастом (ось абсцисс) и соотношением энантиомеров аспарагиновой кислоты в дентине (ось ординат).

Результаты хроматографического анализа приведены в таблице.

Значения хроматографических критериев для определения биологического возраста человека в дентине

Выбранный параметр продемонстрировал сильную корреляцию с биологическим возрастом человека и, следовательно, может быть использован для построения регрессионной модели и определения возраста. Обнаружено, что корреляция параметров аспарагиновой кислоты аналогична таковой для популяции Польши, о которой сообщили K. Wochna и соавт. [9]. Используя газовый хроматограф с масс-спектрометром, авторы достигли коэффициента корреляции r=0,96—0,98 и абсолютной погрешности ±2,95—4,84. Незначительные различия в результатах могут быть объяснены выбранным материалом. В настоящем исследовании изучали только первый премоляр, в то время как K. Wochna и соавт. использовали клыки и резцы в дополнение к премолярам. Следует отметить, что как в России, так и в Польше популяции имеют относительно близкие хроматографические параметры аспарагиновой кислоты в дентине. В 2014 г. T. Torres и соавт. [10] выявили корреляционную зависимость между уровнем аспарагиновой кислоты и возрастом (r=0,94) для современного населения Испании с использованием газовой хроматографии с флюоресцентной детекцией, что также является сопоставимым результатом. Аналогичная линейная зависимость между биологическим возрастом и параметрами рацемизации аспарагиновой кислоты в дентине была продемонстрирована V. Carolan и соавт. [11], которые с помощью метода жидкостной хроматографии изучали образцы, взятые от удаленных зубов современных пациентов стоматологических клиник и скелетных останков, а также P. Helfman и J. Bada [8] при первых исследованиях динамики аспарагиновой кислоты в тканях зубов. Тем не менее требуются дальнейшие исследования, которые позволят проверить корректность сравнения результатов настоящего исследования с данными, полученными для европейских популяций.

В процессе дериватизации аминокислот могут появляться различные производные аспарагиновой кислоты. Были проанализированы диметиловые эфиры D- и L-аспарагиновой кислоты, поскольку их хорошо известные спектральные характеристики обеспечивают легкую визуализацию с помощью газовой хроматографии — масс-спектрометрии. Собственные исследования показали, что диметиловые эфиры могут широко использоваться для анализа скорости рацемизации аминокислот в обычной практике [6]. Рассчитанное уравнение, однако, применимо и для других производных аспарагиновой кислоты, образующихся в процессе ее дериватизации разными агентами. Регрессионная модель требует соотношения исследуемых веществ, а не их количества, что значительно упрощает хроматографическую оценку полученных результатов. Тем не менее следует отметить, что точность определения возраста в этом исследовании сильно варьировала: средняя абсолютная ошибка составляла ±5,9 года. В ряде случаев полученные значения возраста заметно отличались от паспортного, преимущественно в сторону увеличения. Эти результаты, вероятно, были связаны с качеством образцов дентина. В этих случаях отбор образцов дентина мог быть недостаточно тщательным вследствие сильного разрушения кариесом и других патологических изменений зубной ткани. И при изучении образцов из кариозных зубов соотношение D/L было выше, чем ожидалось. Эти результаты подтверждают данные наблюдения R. Griffin и соавт. [12], при котором авторы получили результаты оценки соотношения D/L в эмали, значительно отличающиеся от показателей здоровых зубов. Следовательно, во время обработки и подготовки образцов к хроматографическому анализу необходимо проявлять осторожность из-за высокой чувствительности метода. Некоторые авторы предложили использовать стоматологические инструменты для извлечения дентина из зубов [8, 13]. Точное иссечение дентина может быть полезно для получения чистых образцов. Однако риск дополнительной рацемизации аминокислот из-за тепла, выделяемого в процессе механического выпиливания дентина, все еще требует изучения, поскольку этот фактор также может привести к завышению биологического возраста. В настоящее время метод определения возраста на основании рацемизации аспарагиновой кислоты в твердых тканях зуба нуждается, кроме того, в дополнительной стандартизации, что подтверждается и собственными исследованиями [14].

Таким образом, доказано, что поиск и проверка новых хроматографических параметров, таких как относительная площадь пика D-аспарагиновой кислоты, полезны для повышения качества процедуры оценки биологического возраста дентина зуба. Данные, полученные при исследовании популяции России, демонстрируют применимость метода для судебно-медицинских целей в РФ. Следует отдельно отметить, что оценку скорости рацемизации в твердых тканях зуба выполняли с использованием стандартного лабораторного оборудования, что позволяет легко внедрить этот метод в судебно-медицинскую практику.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.