Изучение устойчивости 2,6-ди(пропан-2-ил)фенола в биологическом материале

2,6-ди(пропан-2-ил)фенол (2,6-ди(пропан-2-ил)фенол, 2,6-бис(1-метилэтил)фенол, 2,6-диизопропилфенол, пропофол) (далее — 2,6-ди(П-2-ил)Ф) — вещество, наиболее известное как неингаляционный анестетик и применяющееся в медицине, ветеринарии и косметологии. Благодаря способности 2,6-ди(П-2-ил)Ф вызывать амнезию, вещество также используется в лечении ряда психических расстройств, обусловленных травмирующими воспоминаниями [1—3].

2,6-ди(П-2-ил)Ф — это прозрачная жидкая субстанция светло-соломенного цвета, имеющая своеобразный запах. Данное вещество плавится при 18 °C и кипит при 256 °C. Его pKa составляет 11,1 при 20 °C, logP=3,79. В воде растворяется 0,158 г/л (по другим данным — 124 мг/л) 2,6-ди(П-2-ил)Ф. Отмечается хорошая растворимость вещества в этаноле, толуоле, хлороформе, ацетоне, этилацетате. 2,6-ди(П-2-ил)Ф обладает при 20 °C плотностью 0,995 г/см³ [4].

2,6-ди(П-2-ил)Ф обладает выраженным токсическим действием по отношению к теплокровным. LD₅₀ этого вещества составляет при интравенозном поступлении: для мышей — 50 мг/г, для крыс — 42 мг/г, для собак — 30 мг/г; при пероральном поступлении: для мышей — 1100 мг/г, для крыс — 500 мг/г [1, 4].

Как в отечественных, так и в иностранных источниках представлены многочисленные сведения об отравлениях людей 2,6-ди(П-2-ил)Ф. Среди них значительный процент составляют случаи острых отравлений данным соединением с летальным исходом [5, 6]. Смертельные исходы при отравлении 2,6-ди(П-2-ил)Ф обычно связаны с завышением дозы при его медицинском применении [7—9], при разного рода злоупотреблениях, суицидальных и криминальных попытках [10—12]. В Соединенных Штатах Америки (штат Миссури) рассматривалась возможность применения 2,6-ди(П-2-ил)Ф для исполнения смертных приговоров [13].

Все это характеризует 2,6-ди(П-2-ил)Ф как важнейший объект судебно-химического анализа. Однако в судебно-химическом отношении данное вещество продолжает оставаться недостаточно изученным. Например, практически не изучены вопросы, касающиеся характера сохранения 2,6-ди(П-2-ил)Ф в гнилостно разлагающихся биоматрицах.

Цель настоящего исследования — изучение устойчивости 2,6-ди(П-2-ил)Ф в биологическом материале.

Исследуемым объектом явился 2,6-ди(П-2-ил)Ф, произведенный компанией Sigma-Aldrich chemistry (США) и содержащий 97,0% основного вещества.

Как биоматрица рассматривалась печень, не имеющая следов гнилостных изменений (степень дисперсности — 2—4 мм, что достигалось путем измельчения ножницами при температуре биоматериала 2—6 °C). На основе субстрата формировались модельные смеси с аналитом (дисперсность — 5—40 мкм), содержание которого в биоматрице составляло 0,1% [14].

Приготовленные подобным образом модельные смеси сохраняли в темноте, при относительной влажности 50—70% и давлении 100±2 кПа в следующих температурных режимах: –22 °C (условия января севера России), 0 °C (условия ноября центра России), 12 °C (условия апреля центра России), 20 °C (температура в комнате, условия июля центра России) и 30 °C (условия июля юга России). В таких же условиях сохраняли образцы биоматериала (дисперсность — 2—4 мм), не содержащие 2,6-ди(П-2-ил)Ф.

В ходе сохранения образцы биоматрицы, содержащие 2,6-ди(П-2-ил)Ф, и образцы биоматрицы, не содержащие аналит, исследовали с определенной периодичностью на присутствие 2,6-ди(П-2-ил)Ф, параллельно оценивая уровень его количественного содержания.

Схема идентификации и количественного определения 2,6-ди(П-2-ил)Ф в сохраняемом биоматериале состояла в следующем: навеску модельной смеси или контрольного образца (5 г) настаивали с системой этилацетат-ацетон (7:3 по объему) (10 г × 2; время каждого настаивания — полчаса). Извлечения помещали в выпарительную чашку и удаляли растворители в токе воздуха (18—22 °C) [15, 16].

Остаток растворяли в 10 мл трихлорметана, раствор встряхивали вручную 3 мин с буферным раствором, имеющим значение pH среды 11—11,5 (10 мл × 2), водно-щелочное извлечение встряхивали 3 мин с 20 мл диэтилового эфира, органический слой удаляли, а в водно-щелочной слой вводили высаливатель (NaCl) в количестве 7,2 г, подкисляли образующийся раствор 24% HCl до значения pH среды 2—4, после чего экстрагировали этилацетатом (20 мл × 2), а экстракт испаряли при 18—22 °C в токе воздуха. Остаток обрабатывали 2—3 мл смеси гексан-ацетон (7:3), раствор вводили в полупрепаративную (190×10 мм) колонку силикагеля L 40×100 мкм и элюировали со скоростью 0,7 мл/мин аналит-системой гексан—ацетон (7:3). Сбор выходящего из колонки элюата осуществляли в виде фракций по 2 мл. Группу фракций (с 7 по 11 (13—22 мл)), в которых мог присутствовать 2,6-ди(П-2-ил)Ф, помещали в выпарительную чашку, а элюент испаряли.

Остаток обрабатывали 5—8 мл трихлорметана, количественно перенося раствор в мерную колбу на 10 мл, и доводили этим же растворителем содержимое колбы до метки (раствор для исследования). В выпарительные чашки 1 и 2 вносили по 0,5—2,5 мл раствора для исследования, трихлорметан испаряли в токе воздуха при температуре 18—22 °C [17].

Остаток, находящийся в чашке 1, растворяли в 4 мл трихлорметана. Далее 4 мкл этого раствора подвергали исследованию методом газовой хроматографии и масс-спектрометрии. Введение пробы осуществляли с делением потока 1:2. Определение проводили с применением прибора Agilent Technologies модели 6850 Network с масс-селективным детектором 5973 Network, хроматографируя в колонке DB-5 ms EVIDEX (25 м × 0,2 мм) с неподвижной фазой 5%-фенил—95%-метилполисилоксан толщиной 0,33 мкм. При этом температура инжектора составляла 250 °C, интерфейса детектора — 300 °C, квадруполя — 150 °C. Начальную температуру колонки (70 °C) выдерживали 3 мин, после чего повышали до 290 °C со скоростью 20 °C/мин. В качестве газа-носителя использовали гелий (скорость 0,6 мл/мин), в качестве способа фрагментации молекул — электронный удар (70 эВ), диапазон сканирования составлял 40—400 m/z (режим регистрации — по полному ионному току). Аналит идентифицировали по времени удерживания (5,75 мин) и совокупности сигналов заряженных частиц (m/z) в масс-спектре (41, 65, 77, 91, 103, 117, 135, 147, 163 (базовый ион), 178 (молекулярный ион)).

Остаток, находящийся в чашке 2, растворяли в 0,4 мл этилацетата, количественно переносили на стартовую линию пластины «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А-УФ и хроматографировали, используя подвижную фазу гексан—диэтиловый эфир (9:1). Пятна на хроматограммах выявляли, облучая пластины УФ-светом с длиной волны 254 нм, аналит идентифицировали по величине Rf (0,73±0,04).

Аналит в течение 15 мин вымывали из сорбента 5 (10) мл 95% этанола. Элюат спектрофотометрировали (прибор СФ-2000; l=10 мм) в интервале 200—360 нм, идентифицируя аналит по форме спектра и точкам экстремумов (λ_max., нм = 218, 273). По оптической плотности, измеренной при 273 нм, определяли содержание 2,6-ди(П-2-ил)Ф в биоматрице, применяя уравнение регрессии:

А=0,010596·С – 0,000355,

где А — оптическая плотность, С — концентрация аналита (мкг/мл) в растворе, подвергающемся фотометрированию.

Рассмотрена возможность описания и прогнозирования процесса разложения 2,6-ди(П-2-ил)Ф в биоматериале с применением определенной математической модели [17].

Результаты количественной оценки содержания 2,6-ди(П-2-ил)Ф в биоматериале в различные временные моменты его сохранения при пяти температурах отражены на рис. 1 и 2.

Рис. 1. Результаты определения содержания (R, %) 2,6-ди(пропан-2-ил)фенола в биологическом материале в условиях сохранения при температурах −22 °С (1) и 0 °С (2).

Рис. 2. Результаты определения содержания (R, %) 2,6-ди(пропан-2-ил)фенола в биологическом материале в условиях сохранения при температурах 12 °С (1), 20 °С (2) и 30 °С (3).

Как видно из рисунков, продолжительность сохранения аналита в печеночной ткани при температурах –22, 0, 12, 20 и 30 °C составляет соответственно 119. 98. 70, 56 и 42 сут.

Выявлено, что, начиная примерно с времени полуразложения исходного количества 2,6-ди(П-2-ил)Ф, найденного в биоматрице в первые сутки сохранения, кривая зависимости содержания вещества в модельных смесях от продолжительности их сохранения при некоторой постоянной температуре близка к форме гиперболы и, по всей видимости, может быть описана ее уравнением y= k/x, которое в настоящем случаю имеет вид:

R, % = k/t_c,

где R, % — содержание аналита в сохраняемом биоматериале; t_c — продолжительность сохранения (сут), k — коэффициент в уравнении гиперболы.

Результаты изучения зависимости содержания 2,6-ди(П-2-ил)Ф в биоматрице (R, %) от продолжительности (t_c, сутки) сохранения биоматериала при определенной температуре (5 параллельных опытов), явились основой расчета коэффициента k для каждой точки графика зависимости. Из совокупности n отдельных значений k_i находили среднее значение k_ср. и рассчитывали отклонение (как относительную погрешность ε,%) каждого отдельного значения от среднего (k_ср.) по формуле:

ε, %=(k_i − k_ср.)/k_ср.∙100%.

Результаты расчетов значений k_i, k_ср. и ε отражены в табл. 1 и 2.

Таблица 1. Цифровые характеристики кривых гиперболической зависимости уровня содержания 2,6-ди(пропан-2-ил)фенола в ткани печени от времени сохранения при –22 и 0 °С

Примечание. Здесь и в табл. 2: t_с — продолжительность сохранения; R — содержание аналита в биоматрице; k_i — коэффициент в уравнении гиперболы для отдельной точки графика; k_ср. — среднее значение коэффициента для выборки из n значений k_i; ε — относительная погрешность (отклонение k_i от k_ср.).

Таблица 2. Цифровые характеристики кривых гиперболической зависимости уровня содержания 2,6-ди(пропан-2-ил)фенола в ткани печени от времени сохранения при 12, 20 и 30 °С

Как видно из табл. 1 и 2, рассчитанные значения относительной погрешности ε не превышают ±20%.

Значения k_ср. в уравнениях гиперболы, описывающих динамику разложения 2,6-ди(П-2-ил)Ф в ткани печени, при температурах сохранения –22, 0, 12, 20 и 30 °C составляют соответственно 1823, 1130, 697, 510 и 255. Используя рассчитанные значения k_ср., строили график зависимости k_ср. от температуры сохранения биоматериала t°.

Установлено, что в интервале температур от –22 до +30 °C такая зависимость для 2,6-ди(П-2-ил)Ф близка к линейной форме и может описываться уравнением прямой линии y = a∙x+b, или в настоящем случае:

k_ср. = a∙(50 – t°)+b,

где k_ср. — коэффициент в уравнении гиперболы, t° — температура сохранения, 50 — постоянное значение.

После расчета параметров a и b это уравнение приобретает вид:

k_ср.=30,61∙(50 – t°) – 402,39.

Используя это уравнение, можно прогнозировать динамику разложения 2,6-ди(П-2-ил)Ф в биоматрице (ткань печени) при любой температуре, относящейся к изученному диапазону температур.

С этой целью вычисляли коэффициент k_ср., соответствующий выбранной температуре; затем, исходя из вычисленного значения k_ср., рассчитывали гиперболическую кривую теоретической зависимости уровня содержания аналита (R, %) от времени сохранения (t_c, сут).

Применив найденный подход, спрогнозировали динамику разложения 2,6-ди(П-2-ил)Ф в печеночной ткани при температуре −10 °C (условия января центра России), соответствующей исследованному диапазону температур. Вводя в вышеприведенное уравнение величину t°= –10 °C, определяли коэффициент k_ср., который в данном случае был равен 1434. Используя величину k_ср., рассчитывали гиперболу — математическую модель зависимости содержания 2,6-ди(П-2-ил)Ф в биоматрице (R,%) от времени сохранения биоматериала (t_c, сут).

Сравнивали теоретическую (прогнозируемую) зависимость содержания аналита в биоматрице (ткани печени) при –10 °C от продолжительности сохранения (гиперболическая модель) с результатами экспериментального изучения сохраняемости 2,6-ди(П-2-ил)Ф при данной температуре (табл. 3).

Таблица 3. Сравнение прогнозируемых и экспериментально найденных значений содержания 2,6-ди(пропан-2-ил)фенола в биоматрице для условий сохранения при –10 °С

Оценивая полученные данные, можно заключить, что во временно́м диапазоне, начиная с времени полуразложения первоначально определенного количества 2,6-ди(П-2-ил)Ф (35 сут) и до 112 сут сохранения разница между теоретически рассчитанными (гиперболическая кривая) и экспериментально найденными соответствующими значениями уровня содержания аналита в биоматрице не превышает ±17%.

1. Изучена устойчивость 2,6-ди(П-2-ил)Ф в биологической матрице (печень) при температурах –22, 0, 12, 20 и 30 °C. В этих условиях аналит сохранялся соответственно 119, 98, 70, 56 и 42 сут.

2. Установлено, что в основу математического описания динамики разложения 2,6-ди(П-2-ил)Ф в печени при температурах –22, 0, 12, 20 и 30 °C может быть положено уравнение гиперболы. Рассчитанные на основе результатов эксперимента коэффициенты в уравнении гиперболы (k_ср.) для температур –22, 0, 12, 20 и 30 °C равны соответственно 1823, 1130, 697, 510 и 255.

3. По вычисленным значениям k_ср. рассчитано уравнение выявленной линейной зависимости k_ср. от температуры сохранения t°, которое имеет вид:

k_ср.=30,61∙(50 – t°) – 402,39.

Выявлена возможность применения представленного уравнения для прогнозирования процесса разложения 2,6-ди(П-2-ил)Ф в биоматериале при заданной температуре в интервале от –22° до +30 °C.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.