Изучение условий определения и характера устойчивости амлодипина в биологическом материале

Амлодипин относится к классу лекарственных средств, известных как блокаторы кальциевых каналов, производные 1,4-дигидропиридина длительного действия.

Данное лекарственное средство имеет следующие химические и торговые наименования: 5-метил-3-этил{(4RS)-2-[(2-аминоэтокси)метил]-6-метил-4-(2-хлорфенил)-1,4-дигидропиридин-3,5-дикарбоксилат}; 3-этил-5-метил-2-(2-аминоэтоксиметил)-4-(2-хлорфенил)-1,4-дигидро-6-метил-3,5-пиридиндикарбоксилат; АКОС015843475; 3-этил-5-метил(±)-2-[(2-аминоэтокси)метил]-4-(2-хлорфенил)-1,4-дигидро-6-метил-3,5-пиридиндикарбоксилат; 3-O-этил-5-O-метил-2-(2-аминоэтоксиметил)-4-(2-хлорфенил)-6-метил-1,4-дигидропиридин-3,5-дикарбоксилат; 3-этил-5-метил-2-{[(2-аминоэтил)окси]метил}-4-(2-хлорфенил)-6-метил-1,4-дигидропиридин-3,5-дикарбоксилат кадуэт; истин; 88150-42-9; норваск.

Согласно нозологической классификации МКБ-11, соединение применяют при гипертонической болезни и стенокардии [1, 2].

По физическим свойствам амлодипин [в виде бензолсульфоната (бесилата)] представляет собой белый кристаллический порошок, который малорастворим в воде, легко — в метаноле, ацетоне и ацетонитриле, умеренно растворим в этаноле [3—7].

Амлодипин, как и другие представители блокаторов кальциевых каналов, при попадании в организмы теплокровных животных и человека проявляет токсические свойства. Приводимые в литературе значения полулетальных доз амлодипина (в виде бесилата) для крыс в зависимости от пути введения и пола животных составляют от 393 мг/кг (самцы) до 686 мг/кг (самки) [8, 9]. В научной литературе приведены данные о многочисленных случаях отравления амлодипином людей, иногда с летальным исходом [10—17].

Токсические свойства соединения, а также множественные случаи отравления с летальным исходом и достаточно широкое применение в медицинской практике делают его потенциальным объектом судебно-химического анализа.

В доступных источниках имеются сведения об определении амлодипина в сложных биологических матрицах (ткани органов, кровь), однако данные о результатах исследования амлодипина в разлагающемся трупном материале практически отсутствуют [11, 12, 14].

Цель работы — изучение особенностей определения и характера устойчивости амлодипина в биологическом материале.

Объект исследования — субстанция амлодипина бесилата; химическое название — 5-метил-3-этил{(4RS)-2-[(2-аминоэтокси)метил]-6-метил-4-(2-хлорфенил)-1,4-дигидропиридин-3,5-дикарбоксилат}бензолсульфоната — с содержанием основного вещества не менее 99,9%, соответствующая ФС.2.1.0002.15.

Сравнительное изолирование амлодипина из биоматериала 16 изолирующими агентами различной химической природы показало, что оптимальным изолирующим агентом для извлечения аналита из биоматериала следует считать ацетон. Наиболее целесообразные условия извлечения амлодипина данным изолирующим агентом — двукратное (по полчаса) настаивание в режиме периодического перемешивания при соотношении масс ацетона и биоматрицы 2:1 [18—20].

Рассмотрена возможность применения жидкость-жидкостной экстракции для очистки амлодипина от эндогенных примесей биоматрицы на основе попеременного перевода аналита в молекулярной форме в фазу органического растворителя и в солевой форме в водную фазу. Характер межфазового распределения изучали с применением УФ-спектрофотометрии (прибор СФ-2000; толщина слоя поглощения 1 см; аналитическая длина волны — максимум длинноволновой полосы электронного спектра).

Для дополнительной очистки амлодипина от эндогенных веществ биоматериала применяли хроматографию в полупрепаративной (150×10 мм) колонке обращенной фазы Силасорб С-18 (размер частиц 30 мкм), элюируя смесью ацетон-вода (8:2 по объему). В этих условиях вещество присутствует во фракциях элюата № 9—13 (17—26 мл).

Для предварительной идентификации амлодипина использовали нормальнофазную тонкослойную хроматографию (ТСХ) на пластинах Сорбфил ПТСХ-АФ-В-УФ с применением подвижной фазы бутанол-ацетон (5:5).

Подтверждающую идентификацию амлодипина осуществляли методом газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС). Исследования проводили на хроматографе «Agilent Technologies» 7890В GC System с детектором модели 5977А. Способ фрагментации молекул — электронный удар (70 эВ). Регистрация по полному ионному току, сканируемый диапазон 40—600 m/z, колонка НР-5 ms Ultra inert (30 м×0,25 мм) с тонким (0,25 мкм) слоем 5% фенил-95% диметилполисилоксана. Колонку нагревали с температуры 70 °C (после выдержки 2 мин) со скоростью 12,5 °C/мин до температуры 290 °C (выдержка 2 мин). Скорость газа-носителя (гелий) 1 мл/мин. Значения температур инжектора, интерфейса детектора и квадруполя соответственно 250 °C, 290 °C и 150 °C. Предельно обнаруживаемое количество амлодипина в хроматографируемой пробе 0,08 нг.

Рассматривали также возможность определения амлодипина методом УФ-спектрофотометрии (подтверждающая идентификация и количественная оценка содержания). Для этого изучали характер поглощения аналитом УФ-излучения (190—410 нм) в различных химических растворителях (прибор СФ-2000). Количественное определение аналита проводили, используя оптимальную растворяющую среду, в области длинноволнового максимума поглощения, рассчитывали уравнение градуировочного графика.

По результатам полученных исследований разрабатывали и валидировали методику определения амлодипина в биоматериале (модель биоматрицы — ткань печени) по критериям селективности, правильности и прецизионности, принятым в отношении биоаналитических методик. Находили пределы обнаружения и количественного определения.

Разработанную методику использовали для изучения сохраняемости амлодипина в биоматериале в пяти температурных режимах: –25 °C (январь в Северной России), 0—2 °C (октябрь в центре России), 8—10 °C (апрель в центре России), 20—22 °C (июль в центре России) и 36 °C (июль на юге России). Готовили модельные смеси печени (измельчение до 2—4 мм) с аналитом (дисперсность 5—40 мкм), концентрация которого в биоматрице составляла 0,2%.

В процессе сохранения модельные смеси и образцы контрольной биоматрицы подвергали через определенные временные интервалы исследованию на присутствие аналита с параллельной оценкой его количественного содержания.

Результаты изучения экстракции (встряхивание по 4 мин) аналита из водных растворов гидрофобными органическими растворителями в зависимости от pH водного слоя, выраженные значениями коэффициента распределения аналита между органической и водной фазами, представлены на рис. 1. Как видно на рис. 1, наибольшие значения коэффициента распределения достигаются при экстракции амлодипина этилацетатом в диапазоне pH гидрофильной фазы 8,0—11,0.

Рис. 1. Зависимость коэффициента распределения амлодипина между органической и водной фазами от pH водной фазы при экстракции гидрофобными органическими растворителями.

По результатам однократной экстракции амлодипина рассчитано, что для извлечения 98% молекулярной формы аналита этилацетатом из водно-щелочной среды (pH 8,0—11,0; r=1) необходимо двукратное экстрагирование. Такое же количество последовательных экстракций достаточно для извлечения 95—98% аналита в солевой форме кисловодным раствором (pH 0,5—1,5; r=1) из гексана или хлороформа.

Параметры хроматографирования аналита и ряда близких по структуре и свойствам структур в тонком слое нормальнофазового сорбента СТХ-1А с использованием подвижной фазы бутанол-ацетон (5:5) приведены в табл. 1.

Таблица 1. Результаты хроматографирования амлодипина методом ТСХ [подвижная фаза — ацетон-бутанол (5:5)] в присутствии близких по структуре и свойствам соединений

Оптимальной растворяющей средой для определения амлодипина методом спектрофотометрии был выбран 95% этанол.

В среде 95% этанола спектр амлодипина включает три выраженные полосы поглощения с максимумами в области 209, 238 и 362 нм (соответствующие значения молярного коэффициента поглощения — 7842, 22 702 и 36 234).

Разработана методика количественного определения амлодипина по особенностям поглощения УФ-излучения при λ=362 нм в среде 95% этанола. Соблюдение основного закона светопоглощения наблюдается при концентрации 2,5—80,0 мкг/мл. Рассчитанное уравнение градуировочного графика имеет вид: А=0,013747∙С—0,003325, где А — оптическая плотность, С — содержание амлодипина в микрограммах на 1 мл (мкг/мл). При концентрации аналита в фотометрируемом растворе 40 мкг/мл открываемость (n=6; P=0,95) составляет 99,97±0,82%, относительное стандартное отклонение — 0,0078. Предел обнаружения — 1,7 мкг/мл, предел количественного определения — 2,5 мкг/мл.

Изолирование. Пять грамм сохраняемой модельной смеси или контрольного образца биоматрицы настаивали по полчаса с ацетоном (10 г×2), периодически перемешивая через каждые 6 мин (по 1 мин со скоростью 100 об/мин). Извлечения сливали в выпарительную чашку и испаряли растворитель в токе воздуха (18—22 °C).

Очистка. Остаток, полученный после испарения растворителя на завершающем этапе изолирования, обрабатывали 10 мл хлороформа, раствор разбавляли 10 мл гексана и экстрагировали 0,1 М раствором HCl pH 1,1 (20 мл×2). Кисловодное извлечение подщелачивали 20% раствором NaOH до pH 8,0—11,0 и экстрагировали этилацетатом (40 мл×2). Органический экстракт испаряли. Остаток 4 мл ацетона разбавляли в мерной колбе водой до 5 мл.

2 мл вносили в колонку (диаметр 11 мм) сорбента Силасорб С-18 30 мкм (7,5 г). Элюировали смесью ацетон-вода (8:2), собирая по 2 мл элюата в виде отдельных фракций. Фракции № 9—13 (17—26 мл) сливали вместе и полностью испаряли элюент. Остаток растворяли в 5 мл ацетона. Затем 0,1—2,0 и 1,0—2,5 мл ацетонового раствора вносили в выпарительные чашки 1 и 2, растворитель испаряли.

ТСХ. Готовили раствор остатка из чашки 1 в 0,4—0,6 мл ацетона, наносили на пластину Сорбфил, элюировали смесью бутанол-ацетон (5:5), детектировали в УФ-свете и идентифицировали аналит на основе Rf (0,48±0,03).

ГХ-МС. Готовили раствор остатка из чашки 2 в 4 мл хлороформа. Затем 2 мкл анализировали, используя хроматограф «Agilent Technologies» 7890В GC System с масс-селективным детектором 5977А, в приведенных ранее условиях. Аналит идентифицировали по времени удерживания (t_R=11,266 мин) и набору сигналов заряженных частиц в масс-спектре (основной ион 277 m/z) (табл. 2) при условии совпадения с масс-спектром стандарта на 86% и более.

Таблица 2. Результаты идентификации амлодипина методом ГХ-МС

УФ-спектрофотометрия. Аналит элюировали из хроматограммы (ТСХ) 5 мл этанола 15 мин и изучали светопоглощение элюата (190—410 нм). Критерием идентификации амлодипина являлись форма спектральной кривой и положение точек максимумов (λ_max=209, 238 и 362 нм).

По оптической плотности элюата в области длинноволнового максимума (362 нм) определили количество аналита, используя уравнение градуировочного графика.

Провели валидацию методики определения амлодипина в биологическом материале с использованием УФ-спектрофотометрии. Результаты валидационных мероприятий представлены в табл. 3.

Таблица 3. Валидационные характеристики методики определения амлодипина в биологическом материале

Как свидетельствуют полученные данные, разработанная методика соответствует критериям линейности, правильности, прецизионности и селективности.

Пределы обнаружения (ПО) и количественного определения (ПКО) амлодипина на уровне 1,4∙10^–2 и 2,0∙10^–2 мг в 1 г биоматериала.

Изучение характера устойчивости амлодипина в биологическом материале позволило получить результаты (рис. 2): устойчивость амлодипина в биоматериале уменьшается с увеличением температуры, при которой сохраняются искусственные смеси аналита и ткани печени.

Рис. 2. Результаты определения содержания амлодипина (R, %) в биологическом материале в зависимости от продолжительности сохранения при различных температурах.

Установленные сроки сохранения анализируемого вещества при температурах –25 °C, 0—2 °C, 8—10 °C, 18—22 °C и 36 °C составляют соответственно более 120, 112, 105, 91 и 77 сут.

Полученные данные свидетельствуют также о том, что при температуре –25 °C валидационная стабильность амлодипина в биоматрице (колебания содержания не более ±20%) обеспечивается, по крайней мере, в течение 2 мес.

1. Для очистки амлодипина, извлекаемого из биоматериала ацетоном, применена двукратная жидкость-жидкостная экстракция [выход 95—98% аналита в молекулярной (pH 8,0—11,0) или солевой (pH 0,5—1,5) формах] и хроматография в колонке силикагеля L 40/100 мкм.

2. Предложена схема определения амлодипина в биоматериале с использованием ТСХ, ГХ-МС и УФ-спектрофотометрии, обеспечиваюшая ПО и ПКО амлодипина 1,4∙10^–2 и 2,0∙10^–2 мг в 1 г биоматериала.

3. С помощью разработанной и валидированной методики на основе УФ-спектрофотометрии изучена динамика разложения аналита в биоматериале. Валидационная стабильность амлодипина в биоматрице (при температуре –25 °C) отмечается в течение 2 мес.

4. При снижении температуры с 36 °C до –25 °C продолжительность сохранения вещества увеличивается с 77 до более 120 сут.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.