В судебной медицине, согласно пункту 84.10 приказа №346н Минздравсоцразвития от 12.05.10 «Об утверждении Порядка организации и производства судебно-медицинских экспертиз...», требуется определять для анализируемого биологического материала половую принадлежность их владельца, что обусловливает более направленный розыск преступника. Эта задача решается путем проведения молекулярно-генетической экспертизы с выявлением ДНК-последовательностей, специфичных для Y-хромосомы.

До появления метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) присутствие ДНК из Y-хромосомы определяли с помощью дот-блот гибридизации с радиоактивно меченными зондами [1]. Разработка ПЦР открыла новые возможности по детекции последовательностей, специфичных для половых хромосом DYZ1, DXZ4, DYZ5 [2], ZFX и ZFY [3] разных участков генов амелогенина [4, 5]. Со временем основными при определении пола стали амелогениновые локусы AMELY и AMELX. Оказалось, что у некоторых мужчин амелогениновый ген на Y-хромосоме не выявляется [6, 7]. Для каких-то популяций данная проблема стоит довольно остро, например для индийской популяции [8], что обусловило открытие новых гендер-специфичных локусов, в частности SRY [9].

Вследствие относительно частых нарушений половых хромосом [10] ДНК-анализ по ним не всегда дает однозначный результат. Известно, что X- и Y-хромосомы обмениваются генетическим материалом в норме в пределах псевдоаутосомной области (ПАО), но иногда генетическая рекомбинация происходит и за ее границами, приводя к аномалиям, когда появляются женщины XY и мужчины XX. У последних TDF-участки Y-хромосомы, несущие в том числе ген SRY, транслоцированы на короткое плечо X-хромосомы, причем ген SRY располагается очень близко к ПАО, что способствует его переносу на X-хромосому чаще остальных локусов (рис. 1). Для XY женщин TDF-участок изменен настолько, что не выполняет своей функции. Соответственно при использовании SRY-маркера в анализе ПЦР пол таких людей будет определен неверно, по крайней мере, не будет соответствовать фенотипу. В этом случае поиск правонарушителя может пойти по ложному пути: сотрудники оперативно-розыскных служб и следствия будут вести поиск подозреваемого, например, среди мужчин, в то время как биоматериал принадлежал фенотипической женщине. Таким образом, определение пола у людей в целях ДНК-криминалистики — более сложная задача, чем представлялось ранее с учетом классических понятий о мужчинах и женщинах как носителях XY- и XX-кариотипов.

Рис. 1. Локализация генов NLGNX/Y, AMELX/Y, ZFX/ZFY, SRY на половых хромосомах относительно ПАО.

Цель работы — предварительная оценка применимости гендер-специфичных нуклеотидных последовательностей в генах нейролигина человека (NLGN4X и NLGN4Y) в качестве альтернативных ДНК-маркеров пола.

Материал и методы

Исследовали 50 образцов ДНК человека (25 мужчин и 25 женщин), выделенных из цельной венозной крови методом фенольно-хлороформной экстракции [11]. Часть препаратов тотальной ДНК каждого индивида подвергали дополнительно фрагментации ультразвуком. Для этого растворы 1 мкг ДНК в 50 мкл воды облучали в приборе BioRuptor (Diagenode) звуком с частотой 20 кГц в режиме самого интенсивного воздействия («high») в течение 35 мин, обеспечивающего высокую степень фрагментации ДНК [12].

Праймеры F-X (5’-AGTCTCTCCCAGGTCTACTGCTCC-3’), F-Y (5’-GCATTGGAGTTTTCGAAAGACT-3’) и R (5’-CAGAGGCGAGCCTGCAGA-3’) подобрали с помощью OligoAnalyzer 3.1 («Integrated DNA Technologies», США). Их специфичность оценивали с помощью BLAST онлайн-ресурса NCBI, синтез осуществлен в компании «Синтол» (Россия).

ПЦР в реальном времени проводили в ДНК-амплификаторе iQ5 («Bio-Rad Laboratories», США). Реакционные смеси включали объемом 20 мкл тотальную ДНК человека в количестве 3 нг (около 10³ копий мишени) или 30 нг (около 10⁴ копий мишени), 1 мкл каждого из праймеров F-X, F-Y и R с концентрацией 1.0 О.Е./мл и 8 мкл 2.5^× ПЦР-смеси, содержащей интеркалирующий краситель EvaGreen («Синтол», Россия). Каждый ПЦР-образец был представлен в трех повторах. Использовали программу, включающую режим сокращенного по времени термоциклирования: начальная денатурация при температуре 94 °C (3 мин), 40 циклов и более денатурация при 94 °C (1 с), отжиг при температуре 60 °C (5 с) и элонгация при температуре 72 °C (1 с).

Результаты ПЦР анализировали дополнительно методом гель-электрофореза в 10% полиакриламидном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием и визуализацией в приборе Gel Camera System («UVP, Inc.», США).

Результаты и обсуждение

Для определения половой принадлежности биологических материалов человека путем ДНК-анализа ранее было предложено использовать несколько разных генетических локусов, специфичных для X- и Y-хромосом. Однако присущие им недостатки обусловливают поиск новых маркеров, которые обеспечивали бы однозначное установление пола. На наш взгляд, удобными гендер-специфичными локусами могут служить фрагменты генов нейролигина NLGN4X и NLGN4Y, находящиеся недалеко от ПАО половых хромосом, но в то же время имеющие достаточно существенное различие в близости расположения к ней (см. рис. 1). Кроме того, NLGN4Y находится дальше от рекомбинирующего участка, чем локусы AMELY, ZFY и тем более SRY, который расположен чуть ли не вплотную к ПАО. Данные преимущества обусловливают возможность использования генов NLGNX/Y для установления пола человека.

Гомология кодирующих областей генов NLGNX/Y высокая, составляет 96,9% [13], однако между ними выявляются и различающиеся участки. Так, нетранслируемые области первого экзона содержат большое число нуклеотидных замен, а также протяженную инсерцию у гена NLGN4X, обозначенную (X)₁₆₁ (рис. 2).

Рис. 2. Фрагменты нуклеотидной последовательности генов NLGNX и NLGNY и расположение праймеров, подобранных для установления половой принадлежности биоматериала.

Выбрали участки генов NLGNX и NLGNY, амплификация которых с помощью ПЦР обеспечивала бы однозначное определение пола индивида по его биоматериалу. Данные участки подобраны таким образом, что имеют полностью гомологичную нуклеотидную последовательность, с одной стороны, и негомологичную — с другой (см. рис. 2). К указанным участкам подобрали гендер-специфичные праймеры F-X и F-Y, а также общий праймер R, которые сконструированы таким образом, чтобы получались короткие ПЦР-продукты разной длины: 59 и 46 п.о. для нуклеотидных последовательностей из X- и Y-хромосом соответственно. Ранее нами [14] показано, что сближенное расположения праймеров обеспечивает высокую чувствительность и специфичность ПЦР и позволяет с большей эффективностью амплифицировать разрушенную ДНК. Кроме того, становится возможным использовать сокращенный по времени режим термоциклирования в ходе ПЦР-анализа (1, 5 и 1 с для этапов денатурации, отжига и элонгации соответственно) [15]. В результате ПЦР-анализа биоматериалов человека с использованием данных праймеров должен нарабатываться один (для XX-индивидов) или два (для XY-индивидов) продукта ПЦР, что обусловливает наличие одного или двух пиков на кривых плавления и одной или двух полос ДНК на электрофоретическом геле соответственно.

Система праймеров апробирована на выборке из 50 человек (фенотипические мужчины и женщины), являющихся представителями разных рас — европеоидной, монголоидной и негроидной. Праймеры обеспечили удовлетворительную специфичность и высокую чувствительность ПЦР-амплификации, позволив уверенно обнаружить до 10³ копий ДНК-мишени в образце (рис. 3, а). Для всех индивидов ПЦР-анализ обеспечивал характерный профиль кривых плавления: один (при температуре 82,5 °C) либо два (при температуре 78 и 82,5 °C) пика, соответствующих целевым продуктам ПЦР (рис. 3, б). На электрофореграммах наблюдались либо одна полоса размером 59 п.о., либо две полосы размером 59 и 46 п.о. (см. рис. 3, а, врезка).

Рис. 3. Профили ПЦР-амплификации (а) и плавления образующихся ПЦР-продуктов (б).

Цифрами отмечены соответствующие профили и дорожки в электрофоретическом геле (врезка): 1, 3, 5 — ДНК фенотипического мужчины; 2, 4, 6 — ДНК фенотипической женщины; К- — образец отрицательного контроля; 1—4 — 10⁴ копий ДНК-мишени; 5 и 6 — 10³ копий ДНК-мишени; 1, 2, 5, 6 — ДНК, не подвергнувшаяся воздействию ультразвука; 3 и 4 — ДНК, разрушенная ультразвуком.

Дополнительно провели эксперименты с модельной разрушенной ДНК, которой служили препараты, подвергнувшиеся длительному (35 мин) воздействию ультразвука. ПЦР-амплификация подобной ДНК также обеспечила высокую чувствительность анализа (см. рис. 3, а), что согласуется с данными, полученными нами ранее для ПЦР со сближенными праймерами [12]. В целом полученные результаты показали отсутствие у индивидов аномалий строения генов NLGNX и NLGNY.

Заключение

Таким образом, предлагается новый полиморфный локус на основе генов NLGNX и NLGNY для установления половой принадлежности биоматериалов человека, который можно использовать при проведении судебно-медицинской экспертизы [16]. Существенное различие в расположении данных локусов относительно ПАО, а также сочетание разных типов полиморфизма, с одной стороны, и возможность использования гендер-специфичных праймеров «в одной пробирке» (режим мультиплексной ПЦР), с другой, позволяют рекомендовать их в качестве альтернативного или дополнительного маркера при определении половой идентичности человека [17], в том числе в составе систем для ДНК-регистрации населения [18—22]. Внедрение в молекулярно-генетические исследования локуса на основе генов NLGNX и NLGNY поможет с большей достоверностью установить половую принадлежность биологического материала, изъятого с места происшествия.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Данная работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта-гранта РФФИ-мк №18-29-14076.