Многолетние исследования природных сообществ микроорганизмов являются неоспоримым доказательством значимости микробиологических аспектов в различных сферах науки, которые ранее считались не связанными с микроорганизмами [1]. Отдельные работы посвящены потенциальному использованию эколого-физиологических свойств посмертного микробного сообщества (микробиом) для целей судебно-медицинской экспертизы, а ценность некробиома — постоянный предмет дискуссий. Например, при изучении состава посмертного микробиома кожи обнаружили, что видовое разнообразие бактериального сообщества кожи специфично и стабильность его качественных и количественных характеристик может сохраняться на трупе при комнатной температуре до 2 нед [2]. Доказано, что изменение численности микроорганизмов и скорости размножения в процессе разложения указывает на время, прошедшее с момента наступления смерти, и зависит от комплекса абиотических и биотических факторов среды с широким диапазоном переменных, которые оказывают влияние на рост, биоразнообразие и направление развития микробной флоры трупа [3]. В результате формируется сложная иерархическая система, в которой большинство видов (до 96—99%) входит в состав природных микробных сообществ или приурочено к биотопам тела, химический состав которых в процессе гниения постоянно меняется: накапливаются летучие соединения, продукты разложения белков, полисахаридов, жиров; присутствующие следовые количества серы, азота и фосфатов, а также минералы и микроэлементы в виде кальция, калия, натрия, магния, железа, хлора и меди активно включаются в конструктивный и энергетический метаболизм гнилостной микрофлоры [4, 5]. Остановка кровообращения сопровождается массовой гипоксией и провоцирует посмертный аутолиз с повреждением лизосом и последующим разрушением лизосомальными ферментами всех внутриклеточных структур. Высокая концентрация в мертвых тканях углеводов, аминокислот, липидов, минеральных солей создает элективные условия для развития некробиома или танатомикробиома и сопровождается увеличением скорости репликации микробных клеток за единицу времени с последующим накоплением биомассы микроорганизмов. Некрофильная микрофлора последовательно колонизирует ткани через капилляры лимфатической, сердечно-сосудистой систем и слизистые оболочки дыхательной системы [6]. Во время активной стадии разложения труп теряет целостность, обогащенные аммиаком жидкости проникают в почву, что увеличивает концентрацию азота и изменяет кислотность почвы/ложа трупа. Динамика изменения состава прилегающих к трупу территорий или участков инициирует контаминацию микроорганизмами с повышенной потребностью в азотном питании и толерантностью к сдвигам химических факторов среды.

Невозможно переоценить роль микроорганизмов с позиции биологических фактов (явления, процессы или обстоятельства), отражающих данные, необходимые для доказательства юридически значимых обстоятельств. Имеются экспериментальные доказательства возможного применения в качестве критериев установления давности наступления смерти таких биохимических характеристик некробиома, как активность каталазы [7, 8] или казеинолитическая активность [9].

Авторы показали, что связанные с трупами бактериальные сообщества чрезвычайно разнообразны. Они обладают межиндивидуальной вариабельностью высокой степени, что отражается и на их ферментативной активности. Именно этот факт позволяет использовать активность конститутивных и индуцибельных ферментов протеолитиков, относительно стабильных в конкретный момент разложения трупа, в экспертной практике. Возможным использованием микробиологических подходов в практике судебной экспертизы можно считать свойство микробных сообществ формировать тесные ассоциации с различными биоценозами трупа в конкретные сроки постмортального периода при соблюдении ряда критериев.

Цель исследования — выявление экологических особенностей микробного сообщества трупа на ранних и поздних стадиях разложения и определение их судебно-медицинского значения.

Материал и методы

Изучили микрофлору трупа кролика; определили биоразнообразие микрофлоры трупа в различные периоды разложения; выделили трофические группы посмертной микрофлоры, проанализировали динамику их количественного и качественного изменения в зависимости от абиотических факторов окружающей среды (температура, кислотность, влажность почвы).

Экологические особенности микробного сообщества трупа в зависимости от периода разложения изучали в 2017—2019 гг. в полевых и лабораторных условиях. Опытное воспроизведение процесса разложения выполняли на основе модельного эксперимента с использованием трупа кролика Oryctolagus sp.

Постановку эксперимента разрабатывали согласно подходам к моделированию как к общенаучному методу исследования, когда один объект изучают с помощью изучения другого объекта, в каком-то отношении подобного первому, с последующим переносом на первый объект результатов изучения второго [10—12]. Труп кролика выбрали в качестве модельного объекта, основываясь на многолетнем опыте исследовательской деятельности [13—17]. Экспериментальную часть работы проводили в соответствии с необходимыми правовыми документами и этическими нормами.

Для изучения развития гнилостных явлений труп поместили на специально оборудованную площадку в зоне населенного пункта (частный сектор г. Петрозаводска). В течение 13 мес фиксировали трупные изменения от начала гниения до скелетирования, оценивали состояние микрофлоры трупа и динамику основных трофических групп бактерий. Параллельно измеряли температуру окружающей среды (воздух и почва), а также кислотность и влажность почвы с помощью прибора «4В1 pH-метра».

Образцы для анализа отбирали с органов и тканей, в наибольшей степени подвергающихся микробной контаминации. Для получения статистически достоверных результатов все пробы отбирали рандомно троекратно. Микробиологический анализ проводили сразу после отбора образцов. Для этого образцы суспензировали в изотоническом растворе натрия хлорида и в объеме 0,1 мл инокулировали в элективные питательные среды, предназначенные для развития определенной эколого-трофической группы микроорганизмов, участвующей в процессе разложения трупа. Использовали мясопептонный агар, элективную питательную среду с 2% С₂Н₄О₂, питательную среду на основе молочной сыворотки и дрожжевого аутолизата; среды Эндо, Эшби, Мишустина, Виноградского (I и II фазы нитрификации), Имшенецкого, Гильтая, Ван-Дельдена, Якобсона; дрожжевой бульон для железобактерий и двухкомпонентную железосодержащую среду для серобактерий. Для выделения спорообразующих аммонифицирующих бактерий образцы предварительно прогревали при температуре 80 ºC в течение 10 мин, вызывая гибель неспорогенных бактерий. С учетом принадлежности выделяемых микроорганизмов к мезофилам накопительные культуры получали при комнатной температуре от 21±3 °C. Количество представителей определенной физиологической группы учитывали методом предельных разведений с использованием таблицы Мак-Креди. Биоразнообразие выделенных бактерий оценивали по комплексу морфологических, физиологических и биохимических признаков. Доминантные виды бактерий идентифицировали в лаборатории молекулярной диагностики ЦКП «Биоинженерия» Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» (Москва). Генотипирование выполняли с помощью набора реактивов BigDyeTerminatorv.3.1 (AppliedBiosystems, Inc., USA) на генетическом анализаторе ABIPRIZM 3730 (AppliedBiosystems, Inc., USA).

Для статистической обработки полученных данных использовали MS Excel: вычисляли средние значения (М), ошибку среднего арифметического (±m); достоверность отличий по критерию Стьюдента при 95% уровне вероятности. Для анализа биоразнообразия и численных значений основных свойств микрофлоры трупа кролика рассчитывали индексы Симпсона и Менхиника.

Результаты и обсуждение

Обнаружили, что микрофлора трупа кролика принадлежит к домену (Domain) Bacteria и представлена 4 типами (Phylum), 8 классами (Class), 15 порядками (Order) и 21 семейством (Family). Большинство выделенных культур отнесены к типам Proteobacteria и Firmicutes, которые доминировали на протяжении всего периода разложения.

Встречаемость представителей протеобактерий оказалась довольно стабильной и изменялась независимо от срока разложения от 36,12 до 43,1%. Доля фирмикутных бактерий в сообществе уменьшалась по мере увеличения срока разложения — от 52,19% в 1-й месяц разложения до 45,33% по истечении 13 мес. Встречаемость представителей типа Bacteroidetes в 1-й месяц составила 1,9%, в период со 2-го по 5-й месяц — от 0,5 до 1,5% и к 13-му месяцу увеличилась до 4%. Представители типа Nitrospirae обнаруживали в основном на поздних сроках разложения трупа, доля их составляла 0,5% и меньше на протяжении всего эксперимента.

Для доминантных представителей микрофлоры трупа, идентифицированных как Bacillus sp., детектированы полимеразной цепной реакцией (ПЦР) фрагменты генов 16S pРНК с бактериальной парой универсальных праймеров (11f-1492r). Архейных компонентов не выявили. Минорных компонентов в спектрограммах также не было, что свидетельствует о чистоте выделенных культур. В результате выполненного генотипирования и проведенного BLAST-анализа последовательностей ПЦР-продуктов доказано присутствие в составе микрофлоры трупа кролика таких представителей рода Bacillus, как B. albus, B. paramycoides, B. cereus, B. proteolyticus, B. subtilis, B. wiedmannii. Оценка таксономического положения исследованных образцов, согласно RDP Classifier, была на уровне 95% достоверности: Domain Bacteria, Phylum Firmicutes, Class Bacilli, Order Bacillales, Family Bacillaceae, Genus Bacillus.

Для объективной интерпретации вариабельности между таксонами микроорганизмов в составе трупа кролика в различные периоды разложения рассчитали значения экологических индексов биологического разнообразия: индекса Симпсона — 1-D (рис. 1), основанного на формуле дисперсии, и индекса Менхиника — DMn (рис. 2).

Рис. 1. Значения индекса Симпсона.

Рис. 2. Значения индекса Менхиника.

Использование указанных индексов объясняется тем, что 1-D чувствителен к количеству видов в сообществе, но малочувствителен к их численности, а индекс DMn более чувствителен к численности отдельных видов микроорганизмов. При анализе индексов учитывали, что изучаемый тип разнообразия относится к дифференцированному b-разнообразию, что означает мозаичное разнообразие, изменение между частями мозаичного сообщества. Согласно рассчитанным значениям индексов Симпсона и Менхиника выявили ряд особенностей. Величина индекса Симпсона, основанного на относительном обилии видов исследованных микробных сообществ в трупе кролика, изменялась от 0,10 до 0,21. Наибольшее доминирование одного или нескольких видов в составе посмертной микрофлоры отметили на 2-м месяце разложения трупа, а наименьшее — на 13-м.

Наибольшая величина индекса Менхиника (30,93) установлена для 8-го месяца разложения трупа и соответствовала большему разнообразию микроорганизмов, а наименьшая (18,93) — минимальному разнообразию, характерному для 3-го месяца разложения.

По типу питания выделенные бактерии отнесли к 7 трофическим группам: аммонификаторы, нитрифицирующие бактерии, целлюлозолитики, возбудители молочно-кислого и уксусно-кислого брожения, азотфиксаторы и денитрифицирующие бактерии. На протяжении всего эксперимента количество трофических групп бактерий в составе посмертной микрофлоры существенно изменялось от начальной стадии разложения до скелетирования. Доминировали аммонифицирующие бактерии семейства Bacillaceae, на их долю в сообществе в различные периоды разложения приходилось от 29,4 до 37,8%. Количество целлюлозолитиков при увеличении продолжительности периода разложения трупа уменьшалось с 17,9 до 4,2%. Доля трофических групп бактерий, вызывающих брожение, азотфиксацию и денитрификацию, независимо от периода разложения всегда оставалась минимальной и не превышала 0,7% для молочно-кислых бактерий, 0,2% для уксусно-кислых и 0,6% для денитрификаторов.

Динамика трофических групп бактерий в составе посмертной микрофлоры сопровождалась изменением температуры окружающей среды и трупа, pH почвы и трупа и влажности почвы (таблица). В период активного гниения (1—2 мес) температура почвы снизилась на 2 °C, а температура трупа на 2,9 °C, при этом кислотность трупа оставалась постоянной, а почва стала более кислой в 1,2 раза. Температура почвы в зоне микробной трансформации костных фрагментов изменилась от 12 до 7,3 °C, а pH от 6,3 до 8,3. Измерение влажности почвы позволило отнести ее к сухой в 1-й месяц, к влажной со 2-го по 6-й месяц и в конце эксперимента, к нормальной — с 8-го по 11-й месяц разложения.

Изменение параметров окружающей среды в различные периоды разложения

Примечание. *DRY — сухая; **WET — влажная; ***NOR — нормальная.

Полученные результаты можно объяснить накоплением органических кислот в почве в зоне ложа трупа, что опосредовано метаболической активностью целлюлозолитических, молочно-кислых и уксусно-кислых бактерий, общая доля которых в составе посмертной микрофлоры к началу процесса скелетирования составила 18,8%. С увеличением продолжительности скелетирования доля бактерий, вызывающих брожение, постепенно снижалась до 4,7% (13-й месяц с момента наступления смерти). Можно предположить, что защелачивание почвы в зоне ложа трупа до 8,3 явилось последствием массового развития аммонификаторов рода Bacillus, которые оставались доминирующей трофической группой к завершению модельного эксперимента.

В результате воспроизведения процесса разложения трупа и ежемесячного мониторинга биотических и абиотических параметров с использованием модельного объекта (Oryctolagus sp.) получили первичные характеристики экологических особенностей посмертной микрофлоры применительно к заданным условиям. Это качественные и количественные показатели микрофлоры трупа кролика, вариабельность между таксонами, изменение разнообразия трофических групп в сочетании с температурой и кислотностью окружающей среды и трупа, а также в зависимости от влажности почвы в зоне ложа трупа.

С помощью бактериологических методов в составе посмертного микробиома обнаружили присутствие основного домена Bacteria типов: Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes, Nitrospirae, классов Bacilli, Bacteroidea, Clostridia, Nitrospira и Proteobacteria, порядков Bacillales, Bacteroidales, Burkholderiales, Cellvibrionales, Clostridiales, Desulfovibrionales, Enterobacterales, Hydrogenophilales, Lactobacillales, Myxococcales, Nitrosomonadales, Nitrospirales, Pseudomonadales, Rhizobiales, Rhodospirillales, семейств Acetobacteraceae, Alcaligenaceae, Pseudomonadaceae/Azotobacteraceae, Bacillaceae, Bacteroidaceae, Bradyrhizobiaceae, Cellvibrionaceae, Clostridiaceae, Comamonadaceae, Desulfovibrionaceae, Enterococcaceae, Enterobacteriaceae, Hydrogenophilaceae, Lactobacillaceae, Nitrospiraceae, Nitrosomonadaceae, Myxococcaceae, Morganellaceae, Myxococcaceae, Pseudomonadaceae, Staphylococcaceae, Streptococcaceae.

Выполнили генотипирование доминантных представителей микрофлоры трупа, идентифицированных как Bacillus sp. Использование генотипирования позволило дополнить перечень описанных таксонов видами рода Bacillus: B. albus, B. paramycoides, B. cereus, B. proteolyticus, B. subtilis, B. wiedmannii.

Впервые описано биоразнообразие бактериальных сообществ трупа на основании полученных значений индексов Симпсона и Менхиника. Необходимо отметить, что применение экологических индексов позволило не только сравнить обнаруженные таксоны бактерий, но и выделить наиболее важные, влияющие на интенсивность процесса разложения. В относительно небольшой период разложения трупа и его скелетирования наблюдали повышение конкуренции между различными трофическими группами бактерий. Подтверждено уменьшение биоразнообразия, вероятно, и за счет преимущества синергизма при микробной ферментации.

Заключение

Таким образом, проведенные исследования подтвердили возможность определения потенциальных таксонов бактерий, присутствие которых в мертвых тканях соответствует различным периодам разложения трупа. Это может быть использовано в качестве дополнительного критерия объективной оценки продолжительности посмертного интервала с экологической точки зрения. На примере экспериментальной биологической модели показано, что изменения посмертного микробного сообщества повторяются, могут быть измерены и вместе с анализом традиционных судебно-медицинских методов позволяют уточнить время наступления смерти. Предполагается продолжение исследований о репрезентативности данных, полученных на модельном объекте, для трупа человека.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Работа выполнена в рамках государственного задания Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (тема №0752-2020-0007) и реализации Программы развития опорного университета ФГБОУ ВО «Петрозаводский государственный университет» на период 2017—2021 гг.