Проблема острого и летального отравления клобазамом до настоящего времени остается актуальной задачей судебно-медицинской экспертизы. По данным ежегодного токсикологического мониторинга органов Роспотребнадзора, острые отравления наркотическими средствами (НС) до сих пор актуальны. В структуре всех острых отравлений лидирующее место занимают отравления лекарственными препаратами. Потребление НС и психотропных веществ (ПВ), не повлекшее смертельного исхода, является объектом изучения клинических специалистов, а острое отравление с летальным исходом — судебных медиков. В настоящее время судебно-медицинская диагностика отравлений НС и ПВ со смертельным исходом основана на совокупности морфологических данных (макро- и микроскопических) и результатов определения наличия веществ в биологических жидкостях и тканях трупа. По результатам судебно-химического исследования устанавливают вид НС и ПВ и их концентрацию, что позволяет высказать суждение о времени приема, а также дозе [1]. С данной задачей принято справляться при проведении судебно-химических исследований.

Лекарственное вещество клобазам относится к группе бензодиазепинов. Клобазам включен в список психоактивных веществ, оборот которых в Российской Федерации ограничен [2], а его незаконное приобретение, хранение, перевозка, изготовление, переработка без цели сбыта уголовно преследуются по ст. 228 Уголовного кодекса (УК) Российской Федерации (РФ).

В настоящее время актуальна проблема обеспечения нуждающихся пациентов лекарственными препаратами, не зарегистрированными на территории РФ. В этой связи на заседании Правительства РФ №32 2019 г. принято распоряжение, в соответствии с которыми клобазам и ряд других запрещенных в РФ препаратов могут быть закуплены Московским эндокринным заводом для нужд медицины [3]. В связи с этим необходимы контроль за немедицинским использованием данных веществ, а также судебно-химический и химико-токсикологический анализы малоизученных веществ, в том числе клобазама.

Цель исследования — определить актуальность методов установления фактов отравления клобазамом при проведении судебно-химического и химико-токсикологического исследований.

Химическое название клобазама — 7-хлор-1-метил-5-фенил-1H-1,5-бензодиазепин-2,4(3H,5H)-дион. Молекулярная формула C₁₆H₁₃ClN₂O₂. Торговое название на территории РФ — фризиум. Лекарственная форма — таблетки по 10 мг.

Клобазам — противосудорожное, анксиолитическое средство, действует как транквилизатор, относится к сильнодействующим препаратам. Препарат купирует эпилептические приступы, снижает напряженность, раздражение, возбуждение, агрессивность. Клобазам относится ко второму поколению противоэпилептических препаратов [4]. Это лекарственный препарат с меньшими побочными эффектами из производных бензодиазепинов, однако он проявляет фармакокинетическое взаимодействие с такими препаратами, как карбамазепин, фенитоин, фенобарбитал, примидон, вальпроат, ламотриджин, левитирацетам, окскарбазепин, топирамат, вигабатрин, что обусловливает его влияние на сопутствующую терапию и увеличение или наличие побочных эффектов [5].

Показания к применению: симптоматическое лечение при острых и хронических состояниях напряжения, возбуждения и тревоги, эпилепсия (в качестве дополнительной терапии у пациентов, не достигших ремиссии при лечении одним или более противоэпилептическими препаратами).

Физико-химические свойства. При анализе современных фармакопей частные фармакопейные статьи на субстанцию клобазама обнаружили в Европейском и Британском изданиях фармакопей [6, 7]. Данные о физико-химических свойствах клобазама в данном разделе взяты из частной статьи Британской фармакопеи.

Клобазам представляет собой белый или почти белый кристаллический порошок, слегка горький на вкус. Температура плавления 180—182 °C. Мало растворим в воде, умеренно растворим в спирте, очень легко растворим в метиленхлориде. Молярная масса 300,74 г/моль. Клобазам представляет собой 1,5-бензодиазепин, отличающийся наличием атома азота в положениях 1 и 5 бензодиазепинового кольца, а не в положениях 1 и 4, как у 1,4-бензодиазепинов, например, диазепама (рис. 2).

Рис. 1. Структурная формула клобазама.

Рис. 2. Структурная формула диазепама.

По строению клобазам представляет собой бициклическое соединение с двумя атомами азота в 1 и 5 положениях, семичленное кольцо, конденсированное с бензольным кольцом [8].

Фармакокинетика. N-дезметилклобазам (норклобазам) является активным метаболитом клобазама, поэтому многие исследования посвящены сравнению фармакокинетики двух молекул [9]. Исследование фармакокинетики однократной дозы норклобазама как у здоровых добровольцев, так и у пациентов с эпилепсией показало, что введение 30 мг норклобазама увеличивает AUC (изменение концентрации лекарственного средства в плазме крови) для норклобазама примерно на 50% по сравнению с введением 30 мг клобазама. Следует ожидать меньшего AUC норкобазама после введения клобазама, что соответствует фракции клобазама, которая метаболизируется в норклобазам. В организме значительно более устойчив норклобазам, период его полураспада примерно вдвое меньше, чем клобазама — соответственно 78—82 и 36—41 ч, а в терапевтических дозах концентрация в сыворотке крови в 3—5 раз выше. Различные периоды полувыведения клобазама и норклобазама отражаются во времени, необходимом для достижения обоими лекарственными средствами стабильных концентраций. В многодозовых исследованиях клобазам достигает стабильной концентрации в течение 1 нед после начала лечения, в то время как установление постоянной концентрации норклобазама может занять до 3 нед.

Клобазам быстро всасывается из кишечника: максимальная концентрация в плазме крови достигается в течение 0,5—3,0 ч с последующей максимальной концентрацией норклобазама через 3—56 ч. На скорость всасывания клобазама не влияет возраст или пол пациента. После всасывания клобазам быстро распределяется по всему организму. Обнаружили, что прием клобазама с пищей вызывает небольшое снижение C_max клобазама, а также задержку T_max, однако не наблюдали заметного влияния на AUC или период полувыведения. В настоящее время в информации о назначении указано, что клобазам можно принимать с едой или без еды.

При попадании в кровь как клобазам, так и норклобазам связываются с белками (90 и 89% соответственно). Клобазам связывается в основном с плазменным альбумином. Только несвязанные молекулы клобазама и норклобазама способны преодолевать гематоэнцефалический барьер. Клобазам и норклобазам являются липофильными соединениями, имеют низкую молекулярную массу и способны образовывать только две—три водородные связи. В связи с этим представляется вероятным, что они оба способны свободно диффундировать через гематоэнцефалический барьер без участия конкретного переносчика [9, 10].

Метаболизм. Клобазам активно метаболизируется в печени путем микросомального окисления ферментами цитохрома Р-450, при этом только 3% исходной дозы выводится в неизмененном виде. Около 70% молекул клобазама деметилируется с образованием норклобазама. Оставшиеся 27% клобазама образуют восемь других метаболитов, каждый из которых считается неактивным. Из этих неактивных метаболитов наиболее часто обнаруживается 4’-гидроксиклобазам. Норклобазам и 4’-гидроксиклобазам далее метаболизируются до неактивного метаболита 4’-гидрокси-N-десметилклобазама. Клобазам и его метаболиты выводятся с мочой и калом, причем скорость выведения клобазама увеличивается с возрастом пациента [9, 10].

Фармакодинамика. Клобазам и норклобазам действуют на постсинаптические ГАМК-рецепторы. Считается, что клобазам является частичным (селективным) агонистом ГАМК по сравнению с другими бензодиазепинами, которые являются полными агонистами ГАМК [9,10].

В данном исследовании изучены различные методы обнаружения и определения клобазама, используемые в мировой судебно-медицинской практике при установлении фактов отравления клобазамом.

Методы обнаружения и определения клобазама

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Описана методика идентификации клобазама в растворах [11]. Представлен подход к выбору оптимальных условий проведения хроматографического анализа (подвижная фаза, pH, стационарная фаза, длина волны обнаружения, скорость потока). Для разделения и обнаружения клобазама (рис. 3) предложены следующие подвижные фазы: метанол:вода (60:40) — время удерживания 2,21 мин; метанол:ацетонитрил:вода (45:40:15) — время удерживания 16,36 мин; метанол:ацетонитрил:вода (70:25:5) — время удерживания 9,32 мин; метанол:ацетонитрил (60:40) — время удерживания 1,37 мин. Максимумы поглощения клобазама находятся в диапазоне от 240 до 260 нм. Наиболее подходящая УФ-детекция клобазама (без влияния наполнителей, растворителя) при λ=254 нм и скорости потока в диапазоне 1 мл/мин.

Рис. 3. Стандартная хроматограмма клобазама в подвижной фазе A со скоростью потока 1 мл/мин при температуре колонки 25 ºС.

Инфракрасная спектроскопия (ИК). Инфракрасная спектроскопия с Фурье-преобразованием (FTIR) — FTIR-анализ выполнена с помощью системы Shimadzu IRAffinity-1 CE с программным обеспечением IR Solution и образец клобазама непосредственно проанализирован с помощью системы ATR (Attenuated TotalReflection) [6, 7].

Ультрафиолетовая спектроскопия (УФ). Описана методика УФ-спектроскопии клобазама в растворе [6, 7]. УФ-спектроскопию проводили с помощью системы Shimadzu UV-3600, подготовку образца осуществляли с помощью 5 мг клобазама, растворенного в 25 мл метанола в качестве растворителя. Отобрали 1 мл исходного раствора и разбавили до 50 мл растворителем. На рис. 4 представлен УФ-спектр клобазама при длине волны от 200 до 400 нм.

Рис. 4. УФ-спектр клобазама.

Газовая хроматография-масс-спектрометрия (ГХ-МС). По данным авторов [12], анализ спиртового раствора клобазама выполняли с помощью системы Shimadzu GC-MS QP2010 с программным обеспечением анализатора реального времени GCMS в режиме EI. Температура от 50 до 300 °C, скорость 20 °C/мин. В качестве газа-носителя использовали гелий при скорости потока 2,5 мл/мин. Объем образца 1мкл; приготовление образца проводили с помощью 5 мг препарата клобазама, растворенного в 25 мл метанола в качестве разбавителя.

Газовая хроматография (ГХ). Клобазам и его основной метаболит в сыворотке N-десметилклобазам определяли методом ГХ с использованием методики, описанной для 1,4-бенздиазепинов [12].

К 1 мл сыворотки в пробирке для центрифугирования добавляли 0,1 мл раствора внутреннего стандарта и смешивали с 5 мл этилового эфира в миксере Vortex в течение 30 с. Центрифугировали в течение 5 мин в холодильной центрифуге при температуре 0—5 °C, переносили около 4 мл органической фазы в пробирку Беккета и упаривали досуха при температуре около 40 °C в потоке азота. Остаток растворяли в 50 мл этилацетата и хранили в холодильнике до анализа.

Оценку проводили с помощью интегратора по методике внутреннего стандарта, в которой площади пиков определяемых соединений сравнивали с площадью пиков диазепама. Можно также оценивать путем сравнения соответствующих высот пиков на хроматограмме.

Смеси клобазама и N-десметилклобазама разбавляли в сыворотке. Образцы сыворотки разделяли для получения шести идентичных серий разведений. Проведенные исследования показали (рис. 5), что абсолютные ошибки хорошо коррелируют и образуют прямую линию, которая не проходит через начало координат. Таким образом, точность метода, рассчитанного для клобазама, составила 0,002%/1+2,2% от измеренного значения.

Рис. 5. Определение клобазама и N-десметилклобазама в сыворотке крови методом газовой хроматографии.

а — пустая сыворотка; б — добавлено 0,05 мг/л каждого соединения к пробе сыворотки; в — уровень сыворотки после 5-го приема клобазама; I — внутренний стандарт; C — клобазам; N — N-десметилклобазам; U — неизвестное.

Флюорометрия. Клобазам можно определить с помощью флюорометрии [12]. Метод проявляет нативную флуоресценцию, но может быть преобразован в флуорофор путем облучения коротковолновыми УФ-лучами. Использовали лампу Pen-Ray 11 Sc 1; камеру облучения с двумя ячейками по 1 см; флюорометр Perkin Elmer MPF3; стандартный раствор клобазама в этиловом спирте концентрации 0,5 мг/л.

Методика определения клобазама. К 1 мл сыворотки в пробирке для центрифугирования добавляли 5 мл этилового эфира и встряхивали в течение 30 с в миксере Vortex. Центрифугировали растворы, отбирали 4 мл из надосадочной эфирной фазы в пробирку и выпаривали досуха при температуре около 40 °C в потоке азота. Собирали остаток с 2 мл этилового спирта (раствор образца) и хранили в защищенном от света месте. В камере облучали 2 мл стандартного раствора УФ-лучами в ячейке 1 см в течение 1 мин. Образец раствора помещали в ячейку и измеряли (значение 1). Затем облучали образец раствора и повторяли измерение (значение 2). Значение 1 (необлученный раствор) рассматривается как «пустое» значение и вычитается из значения 2. Для сывороток, содержащих стандартные количества соединения, устанавливали калибровочные кривые. Калибровка линейна до концентрации клобазама 5 мг/л.

Данные показали постоянную точность метода 0,016 мг/л в диапазоне концентрации 0,1—1,0 мг на 1 л сыворотки; предел обнаружения клобазама в сыворотке составил 0,04 мг/л.

Флуоресценция N-десметилклобазама составила только треть от флуоресценции клобазама. 4’-гидроксиклобазам и 4’-гидрокси-N-дезметилклобазам показали одну десятую флуоресценции от клобазама. Соединения 1,4-бензодиазепины не мешают данному методу.

Тонкослойная хроматография (ТСХ) в моче. Клобазам и основные метаболиты — N-десметилклобазам, 4’-гидроксиклобазам и 4’-гидрокси-N-десметилклобазам также можно количественно определить методом ТСХ. Например, описана методика определения метаболитов клобазама в моче [12]. Показано (см. таблицу), что соединения легко разделяются на силикагеле с использованием подвижной фазы хлороформ—н-гептан—метанол (85 мл + 10 мл + 5 мл).

Определение метаболитов клобазама в моче с помощью ТСХ

Коэффициент отражения измеряли с помощью обычных приборов для измерения ТСХ (денситометры) при λ=230 нм. Большое количество метаболитов выводится в виде конъюгатов, поэтому мочу перед определением обрабатывали глюкуронидазой. Исследовали только метаболиты клобазама, исходя из того, что в моче не обнаружили исходное вещество. Полученные образцы обрабатывали как описано для свободных и конъюгированных соединений.

На рис. 6 показана кумулятивная экскреция конъюгированных метаболитов с мочой после однократной пероральной дозы 40 мг клобазама, назначенного здоровому добровольцу [13].

Рис. 6. Кумулятивная экскреция с мочой после однократного приема 40 мг клобазама.

1—4-гидроксиклобазам; 2 — N-дезметилклобазам; 3 — 4-гидрокси-N-дезметилклобазам.

Выводы

1. Данные по исследованию клобазама в биологических объектах разрозненные и неполные, что не позволяет проводить направленные судебно-химическое и химико-токсикологическое исследования в биологических объектах на современном уровне.

2. Приведенные данные указывают на необходимость дальнейших исследований по разработке методики качественного и количественного определения клобазама в биологических объектах при судебно-химическом и химико-токсикологическом анализах.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.