2-Метокси-4-(1-пропенил)гидроксибензол [син.: 2-метокси-4-(1-пропенил)фенол, 3-метокси-4-гидрокси-1-пропен-1-илбензол, 2-метокси-4-пропенилфенол, 4-пропенилгваякол, изоэвгенол; далее — 2-МО-4-(1-П)ГОБ] — вещество с биологической активностью, является антисептиком и антиоксидантом [1—4].
Описано анестезирующее действие 2-МО-4-(1-П)ГОБ [5]. В экспериментах на крысах зафиксирован нейропротективный эффект 2-МО-4-(1-П)ГОБ [6].
Отдельно или вместе с некоторыми другими соединениями 2-МО-4-(1-П)ГОБ применяется в косметологии [7].
2-МО-4-(1-П)ГОБ используется как важный полупродукт в ряде разработанных схем получения ванилина химическим и биотехнологическим путями [8]. Описаны процессы преобразования данного соединения в 2-метокси-4-формилгидроксибензол ферментативным путем, а также под воздействием штаммов таких микроорганизмов, как Pseudomonas putida IE27 или Bacillus fusiformis [9—11].
По физическим характеристикам 2-МО-4-(1-П)ГОБ (мол. масса 164,21) представляет собой жидкую, с гвоздичным запахом прозрачную, желтоватого оттенка субстанцию; температура кипения 140—145 °C.
Вещество обладает меньшей устойчивостью, чем его изомер 2-метокси-4-(2-пропенил)гидроксибензол. Последствием фотохимического и фотокаталитического вариантов окисления 2-МО-4-(1-П)ГОБ является его переход в дегидродиизоэвгенол.
2-МО-4-(1-П)ГОБ хорошо растворяется в ди- и трихлорметане, диэтиловом эфире, этилацетате, диметилкетоне, ацетонитриле, этаноле, пропаноле-2, диоксане, плохо в воде и в 1,2,3-тригидроксипропане [1, 2, 12].
Для многих теплокровных организмов 2-МО-4-(1-П)ГОБ является отравляющим веществом умеренной токсичности. Его полулетальная доза при введении per os крысам и морским свинкам равна соответственно 1560 и 1410 мг/кг, при внутрибрюшинной инъекции мышам — 328 мг/кг. В отношении человека и теплокровных животных установлено его местнораздражающее действие, а также проявление им сенсибилизирующего эффекта [13—16].
В научной литературе приведены случаи отравлений, в том числе с летальным исходом, веществами из группы 4-алкенилпроизводных фенола и сложными композициями подобных соединений природного происхождения, одним из которых является 2-МО-4-(1-П)ГОБ [12, 17, 18].
Активное и широкое применение, токсические свойства 2-МО-4-(1-П)ГОБ, случаи летальных отравлений данным веществом определяют его важное химико-токсикологическое значение, однако ряд вопросов судебно-химического анализа 2-МО-4-(1-П)ГОБ остается недостаточно разработанным.
В частности, недостаточно изучен вопрос определения этого вещества в биоматрицах. Практически отсутствуют сведения о динамике разложения данного 4-алкенилпроизводного гидроксибензола в биологическом (трупном) материале.
Цель работы — изучение особенностей определения и динамики разложения 2-МО-4-(1-П)ГОБ в биологическом материале.
Материал и методы
Объект исследования — 2-метокси-4-(1-пропенил)гидроксибензол, или 2-МО-4-(1-П)ГОБ производства фирмы Fluka (Швеция), содержащий ≥98% основного вещества.
Проводили поиск оптимальных условий извлечения 2-МО-4-(1-П)ГОБ из биологического материала. Принимали во внимание результаты изолирования аналита классическими методами, а также сравнительного изолирования рассматриваемого 4-алкенилпроизводного гидроксибензола в режиме инфузии 16 изолирующими жидкостями различной химической природы.
В последнем случае биологическими моделями исследования являлись искусственные смеси исследуемого аналита с тканью печени (дисперсность частиц 2—5 мм) 0,1% концентрации, выдержанные в течение 45 мин при комнатной (18—22 °C) температуре [19, 20].
Настаивание с тем или иным изолирующим агентом проводили двукратно (время каждого настаивания 45 мин, соотношение масс-изолирующей жидкости и биологического объекта 2:1), отдельные извлечения объединяли. От 0,2 до 0,5 мл объединенного извлечения наносили на хроматографическую пластину типа «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А-УФ в виде полосы. Задаваемые условия хроматографирования и детекции: стеклянные цилиндрические камеры вместимостью около 600 см3, температура 18—22 °C, подвижная фаза — гексан-ацетон (9:1), проявление в УФ-лучах (λ=254 нм). Значения Rf 2-МО-4-(1-П)ГОБ и Rs (по отношению к Rf гидроксибензола) составляли соответственно 0,46 и 0,71.
Аналит элюировали из хроматограммы 5 (10) мл 95% этанола (продолжительность контакта сорбента с растворителем 15 мин). Элюат спектрофотометрировали с помощью прибора СФ-2000 в кюветах с толщиной рабочего слоя 1 см. Количество аналита в элюате (мкг/мл) определяли по величине оптической плотности, измеренной при λ=260 нм, используя уравнение градуировочного графика: А=0,11021•С-0,01722.
Рассчитывали значения степени извлечения аналита тем или иным изолирующим агентом. Оптимальный изолирующий агент определяли по наибольшей степени извлечения аналита из биоматрицы.
Исследовали влияние различных факторов на степень извлечения аналита оптимальным изолирующим агентом.
Разрабатывая схему очистки аналита от соэкстрактивных веществ биоматериала, рассматривали возможность применения на I этапе очистки жидкость-жидкостной экстракции. Остаток, полученный после испарения изолирующего агента из объединенного извлечения, содержащий молекулярную форму аналита, растворяли в гидрофобном органическом растворителе, аналит в ионизированной форме переводили в водную фазу, органический слой с гидрофобными примесями отбрасывали, водную фазу промывали от остатков гидрофобных и части гидролипофильных примесей гидрофобным органическим растворителем, аналит в молекулярной форме переводили из водной фазы в органическую.
На II этапе разработки схемы очистки аналита изучали особенности его хроматографирования (проба массой 0,005 г) в колонке силикагеля L 40/100 мкм размером 190×10 мм. 2-МО-4-(1-П)ГОБ обнаруживали во фракциях (по 2 мл каждая) элюата, применяя тонкослойную хроматографию (ТСХ) с использованием указанных ранее условий.
Как возможные методы идентификации 2-МО-4-(1-П)ГОБ рассматривали ТСХ, высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), газожидкостную хроматографию—масс-спектрометрию (ГХ-МС) и УФ-спектрофотометрию.
Для оценки возможности предварительной идентификации аналита методом ТСХ изучали особенности хроматографической активности в тонком слое сорбента СТХ-1А на пластинах «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А-УФ.
Исследовали особенности жидкостного хроматографирования рассматриваемого 4-алкенилпроизводного гидроксибензола в колонке сорбента с привитой фазой С-18 в высокоэффективном режиме на приборе LC-20 Prominence (Shimadzu, Япония) с детектором диодной матрицы SPD-M20A в присутствии близких структур. Объем вводимой пробы — 20 мкл.
Изучали условия идентификации аналита методом ГХ-МС. Использовали газовый хроматограф Agilent Technologies 6850 Network GC System с масс-селективным детектором модели 5973 Network. Используемый вариант фрагментации молекул — электронный удар с энергией 70 эВ, способ регистрации сигнала — по полному электронному току (задержка на растворитель 3,5 мин) [21].
УФ-спектрофотометрия рассматривалась как метод подтверждающей идентификации и количественного определения аналита. Измерения проводили на приборе СФ-2000 в приведенных ранее условиях. Критерии идентификации — форма спектра и положения точек экстремумов (λmax).
Разрабатывали и валидировали методику определения 2-МО-4-(1-П)ГОБ в тканях органов (ткань печени), используя модельные смеси, приготовленные по описанной ранее схеме.
По разработанной методике изучали динамику разложения рассматриваемого 4-алкенилроизводного гидроксибензола в биоматериале. Определяли количественное содержание аналита в модельных смесях, сохраняемых при различных температурах (0—2; 8—10 и 18—22 °C) в зависимости от продолжительности сохранения. В указанных температурных режимах сохраняли также контрольные образцы ткани печени. Каждый раз на исследование брали 5 г модельной смеси, получаемой добавлением 0,005 г порошка аналита (дисперсность 5—40 мкм) к 5 г ткани печени (дисперсность 2—5 мм), или контрольного образца биоматериала. Первое определение проводили через 1 сут после приготовления искусственных смесей, а далее через определенные промежутки времени.
Результаты и обсуждение
Классические методы изолирования показали сравнительно низкую степень извлечения 2-МО-4-(1-П)ГОБ (16—42%) из модельных смесей с биоматериалом. Результаты сравнительного изолирования аналита 16 изолирующими агентами различной химической природы в режиме настаивания по описанной ранее схеме представлены на рис. 1.
Рис. 1. Результаты сравнительного изолирования 2-метокси-4-(1-пропенил)гидроксибензола из биологического материала.
На рис. 1 видно, что наиболее целесообразно изолирование рассматриваемого соединения из биоматериала этилацетатом, позволяющим обеспечить наибольшую степень извлечения аналита.
Исследование влияния различных факторов на степень извлечения аналита этилацетатом показало, что оптимальными условиями извлечения данным изолирующим агентом являются двукратное (как минимум) настаивание при массовом отношении биологический объект-биоматериал 2:1 и продолжительности каждого настаивания 45 мин или более.
Результаты хроматографирования исследуемого соединения и ряда близких химических структур в тонком слое сорбента СТХ-1-А представлены в табл. 1.
Таблица 1. Хроматографическое поведение 2-метокси-4-(1-пропенил)гидроксибензола и близких по структуре веществ в тонком слое силикагеля СТХ-1-А (пластины «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А-УФ)
| Подвижная фаза | 2,4-ДТБГОБ | 2-МО-4-(1-П)ГОБ | 2-А-4-МОГОБ | ГОБ | ||||
| Rf | Rs | Rf | Rs | Rf | Rs | Rf | Rs | |
| Гексан-пропанол-1 (9,5:0,5) | 0,78 | 1,09 | 0,66 | 0,93 | 0,73 | 1,02 | 0,71 | 1,00 |
| Гексан-изобутанол (9,8:0,2) | 0,60 | 3,00 | 0,23 | 1,13 | 0,33 | 1,63 | 0,20 | 1,00 |
| Гексан-метанол (9,5:0,5) | 0,65 | 2,48 | 0,54 | 2,05 | 0,64 | 2,43 | 0,26 | 1,00 |
| Гексан-ацетон (9,5:0,5) | 0,53 | 1,08 | 0,31 | 0,63 | 0,42 | 0,87 | 0,49 | 1,00 |
| Гексан-ацетон (9:1) | 0,71 | 1,08 | 0,46 | 0,71 | 0,60 | 0,92 | 0,65 | 1,00 |
| Гексан-диэтиловый эфир (8:2) | 0,86 | 1,26 | 0,38 | 0,56 | 0,52 | 0,76 | 0,68 | 1,00 |
| Гексан-пропанол-2 (9,8:0,2) | 0,77 | 1,71 | 0,63 | 1,40 | 0,74 | 1,66 | 0,45 | 1,00 |
| Гексан-диоксан (9,5:0,5) | 0,60 | 1,71 | 0,41 | 1,18 | 0,51 | 1,46 | 0,35 | 1,00 |
| Гексан-этилацетат (9,5:0,5) | 0,69 | 1,83 | 0,40 | 1,07 | 0,51 | 1,37 | 0,38 | 1,00 |
| Гексан-этилацетат (9:1) | 0,75 | 1,15 | 0,60 | 0,92 | 0,65 | 1,00 | 0,65 | 1,00 |
| Гексан-хлороформ-пропанол-2 (120:5:1) | 0,66 | 2,30 | 0,48 | 1,65 | 0,61 | 2,13 | 0,29 | 1,00 |
| Гексан-диоксан-пропанол-2 (120:5:1) | 0,69 | 2,29 | 0,49 | 1,63 | 0,63 | 2,08 | 0,30 | 1,00 |
| Гексан-диоксан-пропанол-2 (60:5:1) | 0,76 | 1,56 | 0,56 | 1,15 | 0,65 | 1,33 | 0,49 | 1,00 |
Примечание. 2,4-ДТБГОБ — 2,4-ди-трет-бутилгидрокси-бензол; 2-МО-4-(1-П)ГОБ — 2-метокси-4-(1-пропенил)гидроксибензол; 2-МО-4-(2-П)ГОБ — 2-метокси-4-(2-пропенил)гидроксибензол; ГОБ — гидроксибензол.
Из данных табл. 1 видно, что оптимальными подвижными фазами могут считаться смеси растворителей гексан-ацетон (4:6) и гексан-диоксан-пропанол-2 (60:5:1).
Изучение особенностей хроматографирования рассматриваемого 4-алкенилпроизводного гидроксибензола в колонке силикагеля L 40/100 мкм показало, что оптимальным элюентом в заданных условиях можно считать систему гексан-диоксан (7:3). В этом случае 2-МО-4-(1-П)ГОБ присутствует во фракциях элюата с 4-й по 8-ю включительно (7—16 мл).
Для определения аналита методом ВЭЖХ предложено использовать колонку Discovery C18 HPLC Column размером 250×4,6 мм (Supelco; зернение сорбента 5 мкм) с предколонкой Discovery C18 Supelguard размером 200×4,0 мм (Supelco).
В качестве подвижной фазы лучше применять смеси ацетонитрил-ацетатный буферный раствор pH 5,5 (0,04М CH3COONH4, CH3COOH) 5:5 по объему. Снижение вязкости подвижной фазы достигается термостатированием колонки при температуре 40 °C. Скорость элюирования при этом 1000 мкл/мин. Аналитической является длина волны 280 нм.
Параметры хроматографирования 2-МО-4-(1-П)ГОБ и близких по структуре соединений, рассчитанные для предлагаемых условий проведения процесса, представлены в табл. 2.
Таблица 2. Параметры хроматографирования 2-метокси-4-(1-пропенил)гидроксибензола методом ВЭЖХ в присутствии близких по структуре соединений [колонка Discovery-C18 250×4,6 мм; элюент — ацетонитрил-ацетатный буферный раствор рН 5,5 (5:5)]
| Исследуемое соединение | tR, мин | Относительное удерживание | VR, МКЛ | k′ | N |
| Гидроксибензол | 4,26 | 1,00 | 4261 | 0,375 | 1815 |
| 2-Метокси-4-(2-пропенил)-гидроксибензол | 6,44 | 1,51 | 6440 | 1,08 | 3136 |
| 2-Метокси-4-(1-пропенил)-гидроксибензол | 6,87 | 1,61 | 6869 | 1,22 | 1180 |
Как видно из данных табл. 2, предлагаемые условия хроматографирования обеспечивают достаточно высокие аналитические характеристики.
Для определения методом ГХ-МС пробу вводили с делением потока 1:2. Хроматографировали в колонке DB-5MS EVIDEX (25 м×0,2 мм) со слоем неподвижной фазы 5% фенил-95% диметилполисилоксан толщиной 0,33 мм. Температура инжектора 250 °C, интерфейса детектора 200 °C. Исходную температуру колонки (70 °C) выдерживали 3 мин, затем повышали до 290 °C со скоростью 20 °C/мин. Подвижная фаза — гелий, скорость ее подачи — 0,6 мл/мин. Хроматограмма стандарта рассматриваемого соединения представлена на рис. 2.
Рис. 2. Хроматограммы (метод ГХ-МС) стандарта 2-метокси-4-(1-пропенил)гидроксибензола (а) и этого же вещества, извлеченного из печени (б).
В этих условиях время удерживания 2-МО-4-(1-П)ГОБ составляет 10,39 мин.
Масс-спектр стандарта аналита представлен на рис. 3.
В масс-спектре присутствуют сигналы характеристических ионов (m/z): 40, 55, 65, 77, 91, 103, 121, 131, 137, 149, 164 (основной — 164, он же молекулярный ион).
Рис. 3. Масс-спектры стандарта (а) и извлеченного из печени 2-метокси-4-(1-пропенил)гидроксибензола (б).
Установили, что УФ-спектр исследуемого 4-алкенилпроизводного гидроксибензола в среде 95% этанола при λ=190—360 нм характеризуется наличием двух выраженных полос поглощения (λmax 212 и 260 нм; молярные коэффициенты поглощения соответственно равны 46 715 и 31 427). Для количественного определения целесообразно проведение измерений в области длинноволнового (λ=260 нм) максимума, где влияние фона биоматрицы невелико.
По результатам предварительных исследований предложена схема исследования биоматериала на присутствие 2-МО-4-(1-П)ГОБ.
Схема определения 2-МО-4-(1-П)ГОБ в биологическом материале
Изолирование. 25 г модельной смеси мелкоизмельченной ткани печени с 2-МО-4-(1-П)ГОБ или такое же количество контрольного образца биоматрицы заливают 50 г (55,4 мл) этилацетата и настаивают 45 мин в режиме периодического перемешивания (по 1 мин со скоростью 100 об/мин через каждые 9 мин). Извлечение отделяют от плотных частиц биоматрицы, настаивание повторяют по описанной схеме, первое и второе извлечения соединяют в чашке для выпаривания и удаляют растворитель в токе воздуха при комнатной температуре (18—22 °C).
Очистка аналита. Остаток в чашке растворяют в 10 мл хлороформа, экстрагируют 6% раствором NaOH (10 мл×2), экстракты объединяют, встряхивают 3 мин с 20 мл смеси диэтиловый эфир—гексан (1:1), органический слой отбрасывают, водно-щелочной слой подкисляют 24% раствором HCl до pH 3,0—4,0 и экстрагируют этилацетатом (20 мл×2 по 4 мин). Экстракты объединяют в чашке для выпаривания и удаляют растворитель в токе воздуха при комнатной температуре. Остаток растворяют в 2—3 мл смеси гексан—диоксан (7:3), количественно переносят в мерную колбу вместимостью 5 мл и доводят до метки этой же смесью. Затем 2 мл полученного раствора вводят в колонку силикагеля L 40/100 мкм и хроматографируют в описанных ранее условиях. Фракции элюата, содержащие аналит, объединяют, упаривают до объема 2—3 мл, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 5 мл и доводят до метки элюентом (раствор для исследования). В три фарфоровые чашки (№1, №2 и №3) помещают соответственно 0,2—1,5; 1,5 и 1,5 мл этого раствора и испаряют растворитель при комнатной температуре в токе азота.
Идентификация и количественное определение
ТСХ. Остаток в чашке №1 несколько раз обрабатывают порциями (0,2—0,3 мл) хлороформа и количественно в виде полосы наносят на линию старта пластины «Сорбфил». Хроматографируют, используя подвижную фазу гексан—ацетон (9:1). Пятно аналита на хроматограммах проявляют при облучении их УФ-лучами (λ=254 нм). Аналит идентифицируют по величинам Rf и Rs (относительно Rf гидроксибензола).
ВЭЖХ. Остаток в чашке №2 растворяют в 5 мл ацетонитрила, раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводят до метки буферным раствором pH 5,5. Затем 20 мкл полученного раствора вводят в хроматограф LC-20 Prominence с диодно-матричным детектором SPD-M20A. Хроматографируют в описанных ранее условиях.
Аналит идентифицируют по значению времени удерживания.
ГХ-МС. Остаток в чашке №3 растворяют в 4 мл дихлорметана. Затем 4 мкл раствора вводят в хроматограф и исследуют методом ГХ-МС в описанных ранее условиях. Аналит идентифицируют по времени удерживания и особенностям масс-спектра.
Хроматограмма 2-МО-4-(1-П)ГОБ, а также его масс-спектр приведены соответственно на рис. 2 и рис. 3. Очевидна идентичность хроматограммы и масс-спектра стандарта аналита с хроматограммой и масс-спектром этого же вещества, извлеченного из биоматериала и очищенного по предлагаемой схеме.
УФ-спектрофотометрия. После хроматографирования методом ТСХ аналит элюируют из сорбента 10 мл 95% этанола в течение 15 мин.
Светопоглощение этанольного элюата исследуют в волновом диапазоне 190—360 нм. Аналит идентифицируют по форме спектральной кривой и положению точек максимумов полос поглощения.
Количественное содержание 2-МО-4-(1-П)ГОБ определяют по величине оптической плотности, регистрируемой при λ=260 нм, используя уравнение градуировочного графика.
Валидация предлагаемой методики определения 2-МО-4-(1-П)ГОБ в биологическом материале с использованием УФ-спектрофтометрии показала ее соответствие критериям линейности, правильности, прецизионности и селективности.
Пределы обнаружения (ПО) и количественного определения (ПКО) 2-МО-4-(1-П)ГОБ с помощью разработанной методики равны соответственно 0,36 и 0,4 мг в 100 г биоматериала.
Результаты определения аналита по разработанной методике в модельных смесях с тканью печени приведены в табл. 3.
Таблица 3. Результаты количественного определения 2-метокси-4-(1-пропенил)гидроксибензола в модельных смесях с биологическим материалом (печень)
| Внесено 2-метокси-4-(1-пропенил)-гидроксибензола (в 25 г биологического объекта), мг | Найдено, % (n=5; P=0,95) | ||||
| x | S | Sr, % | Sx | Δx | |
| 50,0 | 81,32 | 1,91 | 2,35 | 0,87 | 2,34 |
| 25,0 | 80,57 | 2,25 | 2,79 | 1,01 | 2,85 |
| 10,0 | 79,84 | 2,49 | 3,12 | 1,11 | 3,09 |
| 2,5 | 79,05 | 2,82 | 3,57 | 1,28 | 3,64 |
| 1,25 | 78,26 | 3,13 | 3,99 | 1,40 | 3,92 |
Как видно из данных табл. 3, при содержании аналита в модельных смесях в концентрациях 0,005—0,2% предлагаемая методика позволяет определять (78,26—81,32)±(2,34—3,92)% 2-МО-4-(1-П)ГОБ.
Результаты изучения динамики разложения 2-МО-4-(1-П)ГОБ в биологическом материале по разработанной методике отражены на рис. 4. Как видно на рис. 4, продолжительность присутствия 2-МО-4-(1-П)ГОБ в биоматрице увеличивается при снижении температуры сохранения.
Установили, что 2-МО-4-(1-П)ГОБ сохраняется в биологическом материале при температуре 0—2, 8—10 и 18—22 °C соответственно 480, 390 и 360 сут.
Рис. 4. Результаты изучения динамики разложения 2-метокси-4-(1-пропенил)гидроксибензола в биологическом материале.
Выводы
1. Для изолирования 2-метокси-4-(1-пропенил)гидроксибензола из биологического материала предложено настаивание с этилацетатом.
2. Показана возможность очистки аналита от эндогенных веществ биоматрицы сочетанием жидкость-жидкостной экстракции и полупрепаративной колоночной хроматографии в силикагеле L 40/100 мкм.
3. Разработана методика определения 2-метокси-4-(1-пропенил)гидроксибензола в биоматериале с использованием ТСХ, ВЭЖХ, ГХ-МС и УФ-спектрофотометрии. Валидация проводилась по критериям линейности, правильности, прецизионности и селективности, пределам обнаружения и количественного определения.
4. С помощью разработанной методики изучили динамику разложения аналита в ткани печени. Установили, что при температурах 0—2, 8—10 и 18—22 °C продолжительность сохранения 2-метокси-4-(1-пропенил)гидроксибензола составляет соответственно 480, 390 и 360 сут.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.