По химической структуре флупентиксол является производным тиоксантена и длительно применяется в психиатрической практике в России [1]. Данные зарубежных исследований свидетельствуют о дозозависимом действии флупентиксола. В дозе до 3 мг/сут флупентиксол оказывает анксиолитическое, антидепрессивное и активирующее действие. По мере увеличения дозы наблюдается ослабление активирующего и антидепрессивного действия препарата, а анксиолитическое действие сохраняется. В дозе 3—18 мг/сут флупентиксол проявляет активирующее свойство и эффективно назначается больным шизофренией с негативным симптомокомплексом [2]. Данные литературы содержат сведения о случаях передозировки и отравления флупентиксолом [3, 4].

Цель работы — анализ распределения флупентиксола во внутренних органах лабораторных животных с целью диагностики острых отравлений.

Материал и методы

При проведении эксперимента использовали стандартный образец (СО) «Флупентиксол» фирмы «Sigma-Aldrich» (Дармштадт, Германия).

Приготовление СО: около 25 мг (точная навеска) флупентиксола помещали в мерную колбу вместимостью 200 мл, растворяли в небольшом объеме метанола, доводили объем колбы метанолом до метки. Затем 1 мл полученного раствора помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводили метанолом до метки.

В эксперименте использовали крыс линии Wistar обоего пола, средняя масса тела 200 г. Все процедуры с животными проводили в соответствии с общепринятыми этическими нормами обращения с животными, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (1986) и с учетом Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997). Для анализа распределения флупентиксола во внутренних органах лабораторных животных с целью диагностики острых отравлений применяли токсическую концентрацию (150 мг/кг) [3]. Забор внутренних органов (селезенка, кишечник, печень, почки, мозг, желудок с содержимым) осуществляли через 30 мин, 1 ч, 3 ч, 6 ч, 9 ч и 15 ч.

Для изолирования флупентиксола из внутренних органов использовали модифицированный метод Васильевой [5, 6].

Флупентиксол в извлечениях обнаруживали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) в системе растворителей: 25% раствор аммиака, этанол (1:1) — этилацетат — ацетон (4:90:45). В качестве детектора использовали УФ-свет (λ=254 нм).

Высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) и тандемную масс-спектрометрию (МС/МС) — ВЭЖХ/МС/МС проводили на жидкостном хроматографе UltiMate 3000 с масс-детектором AmaZonSpeed («ионная ловушка») в режиме электрораспылительной ионизации (ESI), используя анализатор Toxtyper (Bruker). Условия проведения анализа: колонка Acclaim RSLC 120 C18; элюент A: вода, 0,1% муравьиная кислота, 2 мМ формиат аммония (98:1:1); элюент B: ацетонитрил, вода (30:70). Скорость потока — 500 мкл/мин, температура термостата колонки — 40 °C, объем вводимой пробы — 5 мкл. Для масс—спектрометрического анализа использовали источник электрораспылительной ионизации (ESI). Параметры источника ионизации: температура источника ионов — (дефис) 160 °C, напряжение на капилляре 2500 V, давление газа на небулайзере 29 psi, поток осушающего газа 10 л/мин.

ВЭЖХ проводили на приборе Милихром A-02 в разработанных ранее условиях [6].

Количество флупентиксола в извлечениях рассчитывали по СО.

Результаты и обсуждение

Первоначально проводили валидацию методики анализа флупентиксола с помощью ВЭЖХ по показателям: линейность, прецизионность, правильность и предел количественного определения. Линейная зависимость наблюдалась в области концентраций флупентиксола 0,1—1,4 мкг/мл. Коэффициент корреляции составил 0,9968. Полученные данные свидетельствовали, что разработанная методика правильная, прецизионность не превышает ±1,50%, результаты не отягощены систематической ошибкой. Предел количественного определения флупентиксола составил 0,1 мкг/мл.

Для изучения степени влияния биологических матриц на анализ флупентиксола определили его содержание в модельных пробах селезенки, кишечника с содержимым, печени, почек, мозга, желудка [6]. Разработанную методику изолирования использовали для извлечения флупентиксола из внутренних органов лабораторных животных.

В полученных извлечениях флупентиксол обнаруживали с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ). На хроматограммах извлечений присутствовали пятна основного вещества, а также неидентифицированные пятна. Для отличия пятен изучаемого вещества от соэкстрактивных веществ внутренних органов на одну и ту же пластину наносили серии проб извлечений из одноименных объектов. Данные по хроматографической подвижности пятен представлены в таблице.

Значения Rf пятен при обнаружении флупентиксола в извлечениях из внутренних органов лабораторных животных

Rf values of spots in the detection of flupenthixol in extracts from the internal organs of laboratory animals

Таким образом, с помощью ТСХ флупентиксол обнаруживается в извлечениях из внутренних органов лабораторных животных и разделяется пятнами неидентифицированных веществ.

В качестве подтверждающего метода для обнаружения флупентиксола в извлечениях из внутренних органов лабораторных животных использовали ВЭЖХ/МС/МС. Первоначально проводили разделение компонентов извлечений методом ВЭЖХ.

Хроматограмма извлечения из почек представлена на рис. 1, а.

Рис. 1. Хроматограмма (а) и масс-спектр (б) извлечения из почек.

Fig. 1. Chromatogram (a) and mass spectrum (b) of kidney extraction.

На хроматограмме обнаружили пик вещества, соответствующий по времени удерживания пику СО флупентиксола. Аналогично получили хроматограммы извлечений из внутренних органов крыс, на которых был один основной пик со временем удерживания 5,2±0,5 мин, соответствующий времени удерживания СО флупентиксола. Хроматограммы контрольных образцов основной пик не содержали.

Масс-спектр извлечения из почек представлен на рис. 1, б.

Таким же образом измерили масс-спектр извлечений из печени, селезенки, кишечника с содержимым, мозга и желудка. Во всех исследованных извлечениях обнаружили флупентиксол, что позволило сделать заключение о присутствии выраженного молекулярного иона флупентиксола. В масс-спектре извлечения из почек на 30-й минуте выявили молекулярный ион метаболита (629,13 m/z), соответствующего глюкурониду флупентиксола.

Количественное определение флупентиксола в извлечениях из внутренних органов лабораторных животных проводили методом ВЭЖХ. Найденное количество флупентиксола в зависимости от времени представлено на рис. 2. Содержание флупентиксола (мкг/г) в каждой точке графиков определено как среднее значение трех параллельных определений.

Рис. 2. Распределение флупентиксола во внутренних органах лабораторных животных.

Fig. 2. Distribution of flupenthixol in the internal organs of laboratory animals.

На модели острого отравления лабораторных животных показано, что флупентиксол в максимальном количестве обнаруживается в мозге, селезенке и печени, а в желудке, кишечнике с содержимым и почках в меньшем количестве. При исследовании внутренних органов на наличие флупентиксола при остром отравлении в качестве оптимальных биологических объектов рекомендуем использовать печень, селезенку и мозг. Очевидно, флупентиксол обладает энтерогепатической циркуляцией. Максимальное содержание флупентиксола в мозге обусловлено фармакологическим действием препарата.

Заключение

Для обнаружения флупентиксола в извлечениях из внутренних органов лабораторных животных разработана методика с использованием ТСХ. Методы ВЭЖХ и ВЭЖХ/МС/МС позволяют с надежной достоверностью обнаружить флупентиксол во внутренних органах, что поможет в кратчайшие сроки диагностировать острое отравление. Разработанные методики изолирования флупентиксола из внутренних органов лабораторных животных включены в схему химико-токсикологического анализа флупентиксола.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.