Определение возраста имеет большое значение в судебно-медицинской практике идентификации личности. Во всех случаях поступления неопознанных тел в судебно-медицинские отделения процедура установления биологического возраста является обязательной, при этом тактика использования различных методов может быть разной. Например, при значительно выраженных посмертных изменениях тела определение общих признаков личности является основополагающим для возможности отождествить ее с конкретным человеком [1]. В подобных случаях исследования показывают более высокую эффективность выбора комплекса точных и достоверных методов по сравнению с одиночным подходом, который часто оценивается экспертом субъективно [2].

При выборе методов определения возраста следует учитывать, что у каждого метода есть свои преимущества и недостатки. В частности, морфологические методы определения биологического возраста представляют собой простой и легко воспроизводимый алгоритм, который существенно сокращает временные, финансовые и человеческие ресурсы, но при этом на результаты установления возраста может оказать существенное влияние высокая индивидуальная вариабельность изучаемых параметров [3]. Биохимические методы определения возраста, в частности, оценка степени рацемизации аспарагиновой кислоты в дентине зубов, сегодня являются самыми точными и объективными.

Зубы — один из самых прочных органов человеческого тела. Даже при значительных повреждениях или разрушающих трупных изменениях они могут сохранять достаточное количество идентифицирующих признаков. Помимо этого, ткани зуба являются брадитрофными (имеют низкую скорость метаболизма), что является причиной накопления в них D-изомеров аспарагиновой кислоты в результате рацемизации. Рацемизация аминокислот — неферментативная химическая реакция первого порядка, спонтанно проходящая в организме человека на протяжении всей жизни, при которой L-аминокислоты переходят в D-форму. Наиболее высокой скоростью рацемизации обладает аспарагиновая кислота (0,055—0,1% в год), поэтому соотношение ее энантиомеров в ткани зубов в зарубежной практике используют для установления возраста [4].

Применение биохимических методов определения биологического возраста человека, несмотря на высокую точность результатов, ограничено отсутствием единых стандартов хроматографического исследования аминокислотного состава твердых тканей зуба. Существующие методики используют хроматографический анализ, но отличаются выбором оборудования и реактивов. В мировой литературе с помощью одного и того же биохимического метода получают разные результаты определения биологического возраста [5]. Данное обстоятельство послужило поводом к детальному изучению вопроса о техническом подходе к определению биологического возраста человека с использованием анализа аминокислотного состава дентина.

Цель исследования — на основе последних данных об аминокислотном составе дентина изучить используемое оборудование и реактивы, установить возможность влияния их на точность определения возраста в судебно-медицинской практике.

Провели анализ мировой научной литературы за последние 5 лет, в которой отражены результаты изучения аминокислотного состава дентина зубов человека с целью определения биологического возраста. В каждой работе исследовали использованное оборудование, методические подходы, а также параметры хроматографического анализа.

Установили, что за этот период опубликовано 10 зарубежных работ, в которых авторы определяли биологический возраст по тканям дентина. Авторам данных публикаций удалось получить информацию о возрастных изменениях аминокислотного состава дентина на популяциях Китая, Кувейта, Японии, Пакистана, Польши, Индии, Испании и Германии. Практически в каждом случае авторы выбирали различные методические подходы к выполнению исследования (см. таблицу).

Таблица. Последние мировые научные исследования, посвященные проблеме определения возраста по аминокислотному составу дентина, и их результаты

1. S. Chen и соавт. [6] исследовали 58 образцов дентина третьих моляров, полученных от живых доноров в возрасте от 18 до 63 лет в изолированной популяции Китая. Разделение энантиомеров аспарагиновой кислоты выполняли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе «Agilent 1100» (USA) с колонкой «Nova-Pak C8» 150 мм × 3,9 мм × 4 мкм, (Waters). В качестве подвижных фаз использовали 92% ацетатный буфер и 8% метанол, а для облегчения визуализации аминокислот — флуоресцентный детектор с волнами возбуждения λex=340 нм и волнами эмиссии λem=445 нм. Авторы обнаружили сильную корреляцию (r=0,969) между скоростью рацемизации аминокислоты и возрастом донора зуба. Средняя абсолютная погрешность составила 2,19 года, стандартное отклонение ±1,53 года. Авторы отметили, что ВЭЖХ — наиболее удобный и точный метод исследования.

2. M. Elfawal и соавт. [7] для исследования использовали 89 первых премоляров, разделив их на тестируемую (50) и контрольную (39) группы. Содержание энантиомеров определяли методом ВЭЖХ с применением контроллера «600S», насоса «626 HPLC Pump», автоматического пробоотборника «717 Plus» и сканирующего флуоресцентного детектора «474» с λex=340 нм и λem=420 нм. Давление насоса поддерживали 12,4 МПа (124 бар). Разделение D- и L-аспарагиновой кислоты проводили в хиральной колонке «Kromasil C8», 250 мм × 4,6 мм × 5 мкм (USA). Для градиентного элюирования использовали два раствора: натрия ацетат в чистом виде, а также с добавлением метанола. Авторы испытали эффективность разных соотношений ацетата натрия и метанола в процессе дериватизации и добились стандартной погрешности ±1,26 года в тестируемой группе и ±1,12 года в контрольной. Установили коэффициент корреляции r=0,97, сходный с данными, полученными S. Chen и соавт. [6].

3. A. Sakuma и соавт. [8] изучали зубы с феноменом «розового зуба» для определения возраста по степени рацемизации аспарагиновой кислоты. Использовали 3 клыка с указанным феноменом от трупов 23, 53 и 59 лет. Контрольную группу составили пять нормальных клыков от людей 17, 20, 32, 50 лет и 61 года. Разделение энантиомеров аспарагиновой кислоты проводили на газовом хроматографе «Agilent 5975С» с встроенной оптически активной капиллярной колонкой и масс-спектрометром. Средняя погрешность при исследовании «розовых зубов», несмотря на высокую корреляцию аминокислотного состава с возрастом (r=0,990), составила 3,108 года.

4. Q. Hassan и соавт. [9] использовали зубы, удаленные у пациентов 15—60 лет в клиниках Пакистана. Отобрали резцы, клыки, премоляры, первые и вторые моляры. Отношение D- и L-аспарагиновой кислоты изучили на 25 образцах с помощью ВЭЖХ. Отметили высокий коэффициент корреляции (r=0,98). По результатам получили уравнение линейной регрессии, при этом средняя погрешность составила 3,99 года. Авторы отметили высокую стоимость лабораторного оборудования как препятствие к использованию этого метода во многих городах Пакистана.

5. Q. Hassan и соавт. [10] в следующей работе исследовали 100 образцов зубов, удаленных у пациентов известного возраста. Использовали здоровые резцы, клыки, премоляры, первый и второй моляры. Применяли ВЭЖХ, как и в своей предыдущей работе. Результаты исследования 85 образцов использовали для составления уравнения регрессии, остальные 15 — для проверки этого уравнения. Коэффициент корреляции r составил 0,834 для 85 образцов. Не установили влияние пола (p=0,837) и социоэкономического статуса (p=0,35) людей на коэффициент рацемизации в дентине. Напротив, возраст имел достоверную взаимосвязь (p<0,0001). При определении возраста зубов остальных 15 образцов погрешность составила от 0,33 до 9,65 года. Авторы рекомендуют метод радиоуглеродного анализа совместно с ВЭЖХ для повышения точности исследования.

6. K. Wochna и соавт. [11] для изучения скорости рацемизации аспарагиновой кислоты в целях определения возраста в популяции Польши использовали зубы 16 трупов людей мужского пола 20—68 лет. После приготовления образцов их исследовали с помощью газового хроматомасс-спектрометра с хиральной колонкой «Rt βDEXcst» (3 м × 0,32 мм × 0,25 мкм); газ-носитель — гелий. Масс-спектрометр был запущен в режиме мониторинга заданных ионов по массам 158 и 198. Коэффициент корреляции r=0,96—0,98, стандартное отклонение ±2,95—4,84. Авторы советуют применять колонки массового производства, выделяют использованную модель как наиболее удобную и точную.

7. M. Rastogi и соавт. [12] исследовали 90 премоляров нижней и верхней челюстей от доноров известного возраста. Зубы разделили на 9 возрастных групп по пятилетним интервалам. Для изъятия дентина с помощью биопсии создали собственный микротрепан. После подготовки образцов их анализ проводили методом газовой хроматомасс-спектрометрии с использованием хроматографа «Perkin Elmer (Clarus 500)» с автоматическим пробоотборником (Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, USA), а также колонки «CP-Chirasil-L-Val» (25 м × 0,25 мм × 0,25 мкм); газ-носитель — гелий. Для каждой возрастной группы рассчитали уравнения регрессии, стандартную и среднюю погрешность и коэффициент регрессии. В зависимости от группы средняя погрешность варьировала в диапазоне 0,21—1,4 года, стандартная погрешность составила 0,34—1,8 года.

8. T. Torres и соавт. [13] доказали возможность определения возраста по скорости рацемизации аминокислот в дентине зубов как в судебно-медицинской практике, так и в геохронологии. Содержание энантиомеров аспарагиновой кислоты в образцах зубов останков XIV, XIX века и неолита определяли с помощью газового хроматографа «Hewlett Packard 5890»; газ-носитель — гелий. Авторы использовали кварцевую колонку «Chirasil-L-Val Chromopack» (25 м × 0,39 мм × 0,25 мкм) и азотно-фосфорный буфер. Образцы зубов современных живых доноров исследовали методом ВЭЖХ с применением хроматографа «Agilent-1100» и флуоресцентного детектора; λex=335 нм и λem=445 нм. Для данной части исследования использовали колонку «Hypersil BDS C18» (250 мм × 4 мм × 5 мкм). Установили, что значения возраста современных людей, полученные методом ВЭЖХ, незначительно превышают результаты исследования археологических останков с помощью газовой хроматографии.

9. N. Sirin и соавт. [14] для определения возраста по скорости рацемизации аспарагиновой кислоты исследовали зубы, пораженные кариесом. Изучили 99 образцов дентина корней 25 зубов мудрости от доноров в возрасте 21—79 лет. Разделение и определение количества энантиомеров аспарагиновой кислоты проводили на газовом хроматографе «Shimadzu GC-2014» с использованием хиральной капиллярной колонки «Chirasil-L-Val» (Varian). Погрешность определения возраста составила 1,87—3,69 года в трех образцах контрольной группы. В кариозных зубах погрешность достигала 20,39 года, что убедительно доказало влияние кариозного поражения зуба на точность определения возраста данным методом.

10. S. Minegishi и соавт. [15] использовали 39 зубов (первые премоляры, третьи моляры и клыки) от доноров 13—87 лет. Разделение энантиомеров проводили на газовом хроматографе «Agilent 7890B» с пламенно-ионизационным детектором. Применяли капиллярную колонку «Agilent Chirasil-Val», 15 м × 0,3 мм × 1 мкм. Авторы наблюдали сильную корреляцию аминокислотного состава дентина с возрастом (r=0,913—0,948).

Разделение энантиомеров аспарагиновой кислоты в изученных работах авторы проводили на жидкостном или газовом хроматографе с масс-спектрометром, пламенно-ионизационным или флуоресцентным детектором. В большинстве исследований применяли метод газовой хроматографии, для детекции энантиомеров в этих случаях чаще использовали масс-спектрометр или пламенно-ионизационный детектор. Флуоресцентный детектор применяли совместно с ВЭЖХ. Всем авторам в своих исследованиях, несмотря на большое разнообразие технических подходов, удалось добиться достоверных и достаточно точных результатов, которые подтверждают пригодность хроматографического метода определения возраста в рамках идентификации личности неопознанного трупа. Некоторые авторы отметили быстроту приготовления образцов для ВЭЖХ и более высокую чувствительность данного метода по сравнению с газовой хроматографией [6]. Наиболее сильная корреляция скорости рацемизации аспарагиновой кислоты с возрастом показана в исследовании A. Sakuma и соавт. (r=0,990, погрешность определения возраста оказалась равна ±3,108 года, что также является достаточно точным). Наименьшее стандартное отклонение получили M. Rastogi и соавт. (0,34—1,8).

Во всех рассмотренных работах аминокислотный состав дентина изучали методом газовой хроматографии с применением масс-селективного и пламенно-ионизационного детекторов. По результатам исследований можно сделать вывод, что газовая хроматография несколько более эффективна в большинстве случаев определения биологического возраста по аминокислотному составу дентина. Подходящее оборудование для воспроизведения приведенных протоколов исследования в настоящее время имеется в большинстве судебно-медицинских учреждений нашей страны, что является дополнительным преимуществом при внедрении данного метода в практику.

Таким образом, в мировой научной литературе представлено большое число разнообразных методов оценки аминокислотного состава дентина. Широко представлены исследования как здоровых, так и патологически измененных зубов. Наилучшие показатели определения биологического возраста приведены в исследованиях с применением газовых хроматографов с различными типами детекторов. Данные факты позволят оптимизировать подход к изучению аминокислотного состава твердых тканей зуба в России.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.