Изучение динамики постмортальных изменений мертвого тела является одной из актуальных проблем судебно-медицинской танатологии [1—3]. Установление закономерностей, происходящих в посмертном периоде, прямо связано с определением продолжительности этого периода и, соответственно, давности наступления смерти. Дополнительные трудности возникают в случаях, если объект исследования находится в состоянии гнилостных изменений, скелетированных останков с минимальным количеством мягких тканей. Один из путей решения такого вопроса — комплексный подход, в том числе с применением энтомологических и микробиологических данных [4—14], однако в решении его использованы далеко не все возможности.
Цель работы — изучение активности биосинтеза коллагеназ бациллами и клостридиями, выделенными в чистую культуру из микрофлоры костей в различные периоды разложения костной ткани и при разных значениях кислотности среды и температуры культивирования. Исследования относятся к междисциплинарным и выполнены на стыке микробиологии и судебно-медицинской экспертизы.
Материал и методы
Для изучения направленности процессов биогенной деструкции костного коллагена провели серию модельных экспериментов по выделению в чистую культуру коллагеназпродуцирующих микроорганизмов родов Bacillus и Clostridium. Изоляты выделяли методом смывов с поверхности костных фрагментов модельного объекта — кур домашних (Gallus gallus, Linnaeus, 1758) в период с 01.11.18 по 01.05.19 [15]. Фрагменты костей помещали в нестерильную увлажненную огородную почву как модель «почвенной ловушки» для бактерий родов Bacillus и Clostridium, участвующих в разложении костной ткани. Смывы с костей отбирали периодически через месяц стерильным ватным тампоном, смоченным в 1 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида. Для элективного выделения из смывов с поверхности костей спорогенных продуцентов коллагеназ выполняли пастеризацию смывов при нагревании до температуры 80 °C в течение 10 мин [16]. Кислотность и температуру почвы измеряли с помощью pH-метра модели «4В1». Культивирование продуцентов коллагеназ выполняли с увеличением диапазона температур от 20 до 50 °C в суховоздушном охлаждающем термостате ТСО-1/80 СПУ. Статистический анализ полученных данных выполняли на основе программы Microsoft Excel для построения 95% доверительных интервалов усредненных значений.
Идентификацию выделенных бактерий до вида выполняли по комплексу морфологических, тинкториальных, физиологических и биохимических признаков согласно критериям «Определителя бактерий Берги» [17]. Для анализа коллагеназной активности бацилл и клостридий использовали модифицированный метод агаровых блоков Егорова [18]: в случае ферментативной активности вида или штамма микроорганизма наблюдается диффузия фермента в агаризованную среду с коллагеном. Диаметр зоны преципитации (в миллиметрах) соответствовал разрушению 1% субстрата в 1% агаре и активности протеолитического фермента. Питательную среду для визуализации ферментативной активности микроорганизмов готовили по Q. Wu и соавт. [9] в авторской модификации: KH2PO4 — 0,5 г/л; (MgSO4 × 7H2O) — 0,2 г/л; ZnSO4 — 0,1 г/л; NaCl — 1,0 г/л; нерастворимый коллаген — 1%; агар — 1,5%; pH среды 7,2. Исследуемые на биохимическую активность суточные культуры бактерий засевали на поверхность среды методом «газона» в объеме 0,1 мл. С помощью стерильного пробочного сверла (диаметр 3 мм) из слоя среды вырезали агаровые блоки и переносили их на поверхность агаризованной среды с субстратом. Агаровые блоки размещали культуральным ростом вверх, плотно прижимая к поверхности агара. На одной агаровой пластинке размещали четыре агаровых блока с различными штаммами бацилл и клостридий. Посевы выдерживали 1 ч при комнатной температуре для диффузии коллагеназы в агар с коллагеном, а затем помещали в термостат на 24 ч при температуре 37±0,5 °C для инкубирования тест-культур. При положительной коллагеназной активности вокруг блока формировалась зона преципитации. Штаммы с наибольшей коллагеназной активностью вызывали образование максимальных по диаметру зон преципитации.
Одновременно оценивали протеолиз желатина (60% гидролизата коллагена). Бактерии, обладающие ферментом желатиназой, подвергают гидролизу аминокислоты, входящие в состав желатина, в результате чего этот белок теряет свои желирующие свойства, приобретая жидкую консистенцию. Питательную среду для определения желатиназной активности готовили с помощью набора реагентов микро-желатиназа-НИЦФ (021231): ГМФ бульон — 3,0; желатин — 12,0; Na2CO3 — 2,0. Чистые 18-часовые тест-культуры засевали уколом в пробирки с питательным желатином и помещали в термостат при температуре 37±0,5 °C на 3—5 сут. Перед учетом результатов посевы выдерживали в холодильнике 30 мин при температуре 3±2 °C вместе с неинокулированной контрольной пробой [19]. В случае с положительной желатиназной активностью отмечали расплавление желатина, а при отрицательной реакции — отсутствие расплавления.
В результате проведенных исследований отобрали изоляты бацилл и клостридий, идентифицированных как Bac. mycoides, Bac. subtilis, Cl. putrificum, Cl. sporogenes. По критериям «Определителя бактерий Берги» [17] Bac. mycoides и Bac. subtilis отнесены к стрептобациллам с центральным расположением спор и грамположительной клеточной стенкой, хемоорганотрофам, аэробам или факультативным анаэробам, способным к росту при температуре от 10 до 45 ºС. На агаризованных средах росли в виде сухой пленки или морщинистого налета. Основные дифференцирующие признаки представителей рода Bacillus указаны в табл. 1.
Таблица 1. Основные дифференцирующие признаки представителей рода Bacillus
| Вид | Признаки | ||||
| морфологические | культуральные | физиологические | биохимические | тип спор | |
| Bac. mycoides | Гр(+) стрептобациллы | *Сухая пленка **Диффузное помутнение с образованием осадка | Подвижные, метаболизм дыхательный | Крахмал + Казеин + Глюкоза + Каталаза + Маннит – H2S + Гемолизин + | Э |
| Bac. subtilis | Гр(+) стрептобациллы | *Сухой морщинистый налет **Диффузное помутнение с образованием осадка | То же | Крахмал+ Казеин + Глюкоза + Каталаза + Маннит – H2S + Гемолизин + | Э |
Примечание. + — признак положительный для 90—100% штаммов; – — признак отрицательный для всех штаммов; Э — эллипсоидный тип спор; * — рост на плотных средах; ** — рост на жидких средах.
Cl. sporogenes отнесены ко II группе рода Clostridium. При микроскопировании обнаружили полиморфные палочки с центральным расположением спор, грамположительные, хемоорганотрофные, облигатные анаэробы. В анаэробных условиях гниение белка сопровождалось образованием NH3. Cl. putrificum отнесены к IV группе рода Clostridium. Представлены полиморфными палочками с терминальным расположением спор, грамположительные, хемоорганотрофные, облигатные анаэробы. Основные дифференцирующие признаки представителей рода Clostridium указаны в табл. 2.
Таблица 2. Основные дифференцирующие признаки представителей рода Clostridium
| Вид | Признаки | ||||
| морфологические | культуральные | физиологические | биохимические | тип спор | |
| Cl. putrificum | Гр(+) палочки | *Колонии неправильной формы, мутные **Диффузное помутнение | Подвижные, метаболизм бродильный | Желатина + Казеин + Глюкоза + Каталаза – Маннит – H2S + Гемолизин + | С |
| Cl. sporogenes | Гр(+) палочки | *Колонии слизистые, полупрозрачные **Диффузное помутнение | Подвижные, метаболизм бродильный | Желатина +/– Казеин +/– Глюкоза + Каталаза – Маннит – H2S + Гемолизин + | С |
Примечание. +/– признак вариабельный; С — сферический тип спор. Остальные обозначения, как в табл. 1.
За 6 мес разложения костей общее количество штаммов Bac. mycoides изменилось от 9 до 31 КОЕ/мл. Минимальное количество выделенных культур обнаружили в 1-й месяц, а максимальное — на 3-й месяц разложения. В течение всего периода исследования количество коллагенолитических культур оставалось на очень низком уровне и изменялось от 2 КОЕ/мл (1-й месяц) до 7 КОЕ/мл (4-й месяц). Характерно, что через 2 мес нахождения фрагментов костей в почве штаммы Bac. mycoides с коллагенолитической активностью полностью исчезли из состава бактерий бациллярно-клостридиального комплекса (БКК), а далее в течение 4 мес эксперимента выделялись единично, присутствие их в смывах изменялось от 3 до 7 клеток в 1 мл смыва.
В течение всего периода исследований количество штаммов Bac. subtilis в составе БКК смывов с костей оставалось доминирующим и изменялось от 38 до 77 КОЕ/мл, что превышало аналогичные значения по количеству Bac. mycoides в 1-й и 3-й месяцы разложения соответственно в 4,2 и 2,5 раза. К завершению эксперимента количество коллагенолитических культур Bac. subtilis постепенно увеличивалось и достигло 41 КОЕ/мл на 6-й месяц разложения костей.
Общее количество клостридий вида Cl. putrificum и их коллагенолитических вариантов за 6 мес разложения костей менялось от 11 до 16 и от 4 до 5 КОЕ/мл соответственно. Численность Cl. sporogenes, синтезирующих коллагеназы, и Cl. Sporogenes, не способных разрушать коллаген костных фрагментов, постепенно сокращалась, несмотря на высокую общую численность вида в смывах. Необходимо отметить, что все коллагенолитические виды в составе БКК как бациллы, так и клостридии, на протяжении всего периода эксперимента активно разрушали желатин.
При оценке динамики коллагеназной активности обнаружили, что в течение 6 мес эксперимента для большинства изолятов характерно хоть и незначительное, но стабильное увеличение синтеза коллагеназ, контролирующих распад костного коллагена. Разница между начальным и конечным уровнем синтеза фермента для Bac. mycoides соответствовала увеличению зоны преципитации на 2 мм, для Cl. putrificum — на 2,4 мм, а для Cl. sporogenes — на 2,6 мм. Исключение составили штаммы Bac. subtilis, для которых зафиксировали сокращение зоны преципитации на 0,8 мм в результате диффузии коллагеназы в агар с субстратом. Одной из причин низкой каталитической активности можно назвать отклонение показателей кислотности среды от оптимальных для вида значений, которые находятся в пределах 9,0 [12], а в течение эксперимента кислотность почвы изменялась от 6,1 (3-й месяц разложения костных фрагментов) до 8,4 (6-й месяц).
Для проявления каталитических свойств коллагеназ представителей рода Clostridium оптимум pH 7,2 [20], поэтому увеличение кислотности почвы от 6,5 до 7,2 с 1-го по 5-й месяц разложения костной ткани способствовало росту и выработке метаболитов у клостридий в отличие от бацилл. При оптимальных значениях pH 7,2 установили максимальные зоны преципитации, соответствующие коллагеназной активности для Cl. putrificum и Cl. sporogenes, — 10,0 и 9,8 мм. В случае защелачивания среды до 8,4 к 6-му месяцу модельного эксперимента коллагеназная активность клостридий в составе БКК уменьшилась в 1,2 раза для Cl. putrificum и в 1,1 раза для Cl. sporogenes.
Для бацилл оптимальной температурой для коллагеназной активности считается 50 °C [14]. В эксперименте при оптимальном температурном диапазоне среднее значение зон преципитации, соответствующее коллагеназной активности, для Bac. mycoides составило 6,9 и для Bac. subtilis 5,1 мм. Максимум коллагеназной активности бацилл по результатам измерения диаметра зон преципитации фермента оказался 7,6 и 9,8 мм при температуре культивирования 40 ºС.
Коллагеназная активность клостридий проявляется при оптимальной температуре 42 °C [18]. Термостатирование культур при температуре 40 °C вызвало образование зон преципитации, соответствующих коллагеназной активности для Cl. putrificum и Cl. sporogenes, диаметром 6,9 и 7,2 мм соответственно. Максимум коллагеназной активности бацилл по результатам измерения диаметра зон преципитации фермента составил 10,2 и 8,4 мм при температуре 30 °C. Необходимо отметить, что во всех вариантах эксперимента по изучению влияния температурного фактора на активность коллагеназной активности почвенных бактерий в составе БКК некробиома при дальнейшем повышении температуры инкубации уменьшался как рост клеток, так и продукция ферментов. Возможно, снижение температурного оптимума для бацилл и клостридий на 10 ºС объясняется изначально низкими температурами среды обитания почвенных бактерий в период исследования, которая изменялась от 18 до 24 °C.
Заключение
Полученные данные могут быть использованы для установления продолжительности посмертного периода, причин смерти, а также определения условий локации захороненных трупов [21, 22]. Теоретической основой решения этой задачи является доступность трупов как источника азотсодержащей органики: они не только колонизируются микроорганизмами, которые представляют нормальную микрофлору человека, но также видами, которые обычно не способны колонизировать живые ткани или колонизируют их при определенных условиях. К таким видам относятся Bac. mycoides, Bac. subtilis, Cl. putrificum и Cl. sporogenes, которые в основном обитают в почве, контролируя процессы биогеохимической трансформации азота. С помощью серии выполненных исследований по изучению коллагеназной активности БКК микроорганизмов доказано, что ферменты бактерий, обнаруженных в составе микрофлоры костей модельного объекта, являются чувствительными молекулярными маркерами интенсивности разложения костных фрагментов. Установили, что виды рода Bacillus и Clostridium способны гидролизовать коллаген в широких физиологических диапазонах pH и температуры, что соответствует результатам исследований других авторов [14, 20, 23, 24].
Метаболизм Bacillus и Clostridium зависит от кислотности и температуры среды обитания. Изучение протеолитически активных видов, участвующих в разрушении костного коллагена, перспективно для целей судебно-медицинской экспертизы — объективного установления продолжительности позднего посмертного периода, так как субстратная специфичность ферментов бактерий является закономерным биологическим процессом.
Благодарность
Статья подготовлена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках исполнения государственного задания. Выполнено в рамках реализации Программы развития опорного университета ФГБОУ ВО «Петрозаводский государственный университет» на период 2017—2021 гг.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.