При проведении судебно-биологических экспертиз прежде всего устанавливают природу биологических объектов: кровь, сперма, слюна, пот и др.

Особое место занимает экспертиза мекония и кала. Обнаружение этих выделений играет важную роль при расследовании детоубийства (ст. 106 УК РФ) и насильственных действий сексуального характера (ст. 132 УК РФ).

До настоящего времени наличие мекония и кала в следах на вещественных доказательствах устанавливали только цитологическим методом — определяли характерные для этих выделений морфологические элементы. Как показывает практика, такие элементы не всегда выявляются, что значительно затрудняет диагностику [1].

В судебно-медицинской литературе имеются краткие упоминания об исследовании мекония в следах на вещественных доказательствах. Все они посвящены изучению его морфологического состава, что свидетельствует о недостаточном внимании к данному вопросу [2]. Морфологический состав кала изучен довольно подробно, однако единичные попытки определить его ферментный состав не нашли применения в судебно-медицинской практике. Е.А. Ильина [3] предложила метод по установлению наличия кала, основанный на выявлении фермента — щелочной фосфатазы. Способ по обнаружению кала в следах на вещественных доказательствах молекулярно-генетическим методом, предложенный А. Sinelnikov и соавт. [4], несмотря на высокую чувствительность и специфичность, не лишен недостатков.

Таким образом, в настоящее время наличие мекония и кала в следах на вещественных доказательствах устанавливают только микроскопическим методом, который является трудоемким и часто малоэффективным.

Вопрос о ферментном и пигментном составе мекония и кала в следах на вещественных доказательствах практически не изучен; отсутствуют также критерии дифференциальной диагностики данных выделений.

Цель исследования — разработать способы установления наличия мекония и кала в следах на вещественных доказательствах и критерии дифференциальной диагностики данных выделений.

Материал исследования: 50 образцов мекония мертворожденных плодов без признаков гнилостных изменений сроком от 20 до 41 нед внутриутробного развития и давностью хранения от 3 сут до 2 лет; 50 образцов мекония живых новорожденных на 38—41-й неделе внутриутробного развития со сроком внеутробной жизни 1—2 сут и давностью хранения от 3 сут до 2 лет; 50 образцов кала от трупов взрослых лиц в возрасте от 40 до 75 лет без признаков гнилостных изменений и видимых болезненных изменений печени, желчного пузыря, кишечника с давностью хранения от 3 сут до 2 лет. Образцы мекония разделили на группы в зависимости от внутриутробного возраста плодов: 20—24 нед, 25—30 нед, 31—34 нед, 35—41 нед. Пятую группу составили образцы мекония новорожденных со сроком внеутробной жизни до 2 сут.

Образцы мекония мертворожденных плодов получали из нисходящей ободочной и сигмовидной ободочной кишки во время вскрытия. Забор образцов мекония от живых новорожденных производили с пеленок и подгузников после дефекации. Образцы кала брали из прямой кишки во время вскрытия трупов взрослых лиц. Полученный материал равномерно наносили на марлевые тампоны размером 10,0×10,0 см, сложенные в 3 раза, высушивали в вытяжном шкафу при комнатной температуре в открытых чашках Петри без прямого доступа солнечного света. Высушенные образцы хранили в маркированных бумажных конвертах в условиях лаборатории.

Методы исследования: световая и люминесцентная микроскопия; реакция по выявлению амилазы с помощью пробы в крахмально-агаровом геле; реакция по выявлению трипсина методом субстратной пленки; модификация пробы Петтенкофера по установлению наличия желчных кислот; спектрофотометрия и восходящая тонкослойная хроматография.

Исследование морфологического состава мекония и кала. Вырезки из марлевых тампонов помещали в пробирки и экстрагировали 15% раствором уксусной кислоты при температуре 4—8 ˚С в течение 24 ч. Затем их центрифугировали, осадок переносили на предметные стекла, высушивали при комнатной температуре и фиксировали 96% этиловым спиртом.

Препараты изучали с помощью светового микроскопа МИКМЕД-5 без окраски и после обработки раствором Люголя. Для окраски 1—2 капли раствора Люголя наносили на предметное стекло, накрывали покровным, избыток удаляли фильтровальной бумагой и микроскопировали. При исследовании методом люминесцентной микроскопии препараты окрашивали 0,0005% водным раствором акрихина в течение 10 мин. Затем краситель смывали в течение 10 с под струей проточной воды и микроскопировали на люминесцентном микроскопе OLYMPUS CX-41.

Выявление панкреатической амилазы в составе мекония и кала. Использовали пробу в крахмально-агаровом геле. Для этого вырезки из пятен мекония и кала заливали изотоническим раствором натрия хлорида и экстрагировали в течение 24 ч при температуре 4—8 ˚С. На предметные стекла наносили расплавленный крахмально-агаровый гель, в котором после застывания делали отверстия и вносили в них вытяжки из исследуемых образцов мекония и кала. Параллельно в качестве контроля в отдельные лунки вносили заведомую амилазу (слюна в разведении 1:500). Препараты во влажных камерах помещали на 2 ч в термостат при температуре 37 ˚С. По истечении указанного времени стекла извлекали из термостата и окрашивали раствором Люголя. Результаты оценивали визуально. При появлении обесцвеченных участков геля вокруг лунок с исследуемыми объектами, свидетельствующих о гидролизе крахмала, реакцию на наличие амилазы считали положительной [5].

Выявление трипсина в составе мекония и кала. Использовали метод субстратной пленки. На эмульсионный слой проявленной, отфиксированной и промытой фотопленки ФТ-41П производства фирмы «Тасма» (Россия) помещали кусочки фильтровальной бумаги, пропитанные фосфатным буфером рН 8,0, на которые наслаивали вытяжки из исследуемых объектов и контрольный образец трипсина в разведении 1:1000. Фотопленку помещали во влажную камеру и в течение 2 ч инкубировали в термостате при температуре 37 ˚С. По истечении указанного времени влажные камеры с исследуемыми объектами извлекали из термостата, фотопленку с нанесенными вытяжками промывали под струей проточной воды, результаты оценивали визуально. При появлении участков просветления эмульсионного слоя фотопленки, свидетельствующих о гидролизе желатина, пробу на наличие трипсина считали положительной.

Выявление желчных кислот в составе мекония и кала. На предметное стекло помещали по капле вытяжки из пятен мекония и кала и после высыхания добавляли 1 кап-лю 10% раствора сахарозы и 5 капель концентрированной серной кислоты. Для контроля производили вырезки из пятен желчи. Результаты реакции оценивали визуально. При появлении через несколько минут окрашивания вишневого цвета реакцию считали положительной.

Изучение спектров поглощения видимого и ультрафио-летового света. Использовали метод спектрофотомет-рии. Вытяжки из пятен мекония и кала центрифугировали и фильтровали через фильтровальную бумагу. Для исследования пользовались спектрофотометром СФ-2000 со спектральным диапазоном от 190 до 1100 нм под управлением внешнего персонального компьютера типа IBM PC с программным обеспечением СФ-2000. Измерения производили в спектральном диапазоне от 300 до 700 нм с шагом 1 нм. Вытяжки из исследуемых объектов помещали в кюветы спектрофотометра с толщиной поглощающего слоя 1 см и исследовали в режиме «Сканирование». В качестве контроля применяли изотонический раствор натрия хлорида, которым производили экстрагирование объектов. Результаты получали в виде графиков и автоматически осуществляли поиск экстремумов (пики поглощения).

Исследование пигментного состава мекония и кала. Вытяжки из пятен мекония и кала по каплям наносили на хроматографические пластины (ПТСХ-АФ-В) производства фирмы «ИМИД» (Россия). Затем пластины помещали в хроматографические камеры с системой растворителей (бутанол—ледяная уксусная кислота—дистиллированная вода в соотношении 4:1:2). Когда растворитель достигал верхнего края пластины, ее извлекали из камеры и отмечали линию финиша. Для выявления желчного пигмента стеркобилина пластину проявляли реактивом Эрлиха (10% раствор парадиметилбензальдегида в концентрированной хлористоводородной кислоте). Оранжевые полосы на хроматограммах при этом окрашивались в красный цвет, что свидетельствовало о наличии стеркобилина.

При микроскопическом исследовании в образцах мекония всех возрастных групп обнаружили безъядерные клетки рогового слоя многослойного плоского ороговевающего эпителия кожи, мекониевые тельца, кристаллы жирных кислот, глыбки мыл, а в 32% образцов мекония мертворож-денных плодов с 32-й по 41-ю неделю внутриутробного развития и во всех образцах мекония живых новорожденных — пушковые волосы. Частота обнаружения остальных дифференцируемых элементов не превышала 50% от общего числа исследованных образцов.

Особенности морфологического состава мекония обусловлены в первую очередь типом питания плода, стерильностью его кишечника и морфофункциональной незрелостью пищеварительного тракта.

Микроскопическое исследование кала показало, что основная его масса — это недифференцируемый аморфный детрит, среди которого наблюдались фрагменты переваренных и полупереваренных мышечных волокон; зерна вне- и внутриклеточного крахмала; элементы перевариваемой и неперевариваемой растительной клетчатки; йодофильная микрофлора в виде палочек и кокков; кристаллы жирных кислот и глыбки мыл. Полупереваренные и непереваренные мышечные волокна, которые имеют наиболее важное диагностическое значение, обнаружили в 10% исследованных образцов, причем максимальное количество этих элементов не превышало двух в одном препарате. Частота встречаемости остальных дифференцируемых элементов составляла не более 30%.

Морфологический состав кала в следах на вещественных доказательствах изучен подробно. Данные, полученные в ходе нашего исследования, подтверждают результаты других авторов [1, 6, 7].

Таким образом, в ходе исследования установили отличия морфологического состава мекония и кала. Так, в кале в отличие от мекония выявили полупереваренные волокна мышечной и соединительной тканей, неперевариваемую и перевариваемую растительную клетчатку, зерна вне- и внутриклеточного крахмала, колонии йодофильной мик-рофлоры. В меконии содержались мекониевые тельца, пушковые волосы, клетки рогового слоя многослойного плоского ороговевающего эпителия кожи.

Указанные отличия морфологического состава выделений могут быть использованы как для обнаружения мекония и кала в следах на вещественных доказательствах, так и при их дифференциальной диагностике.

Следует отметить довольно низкий процент обнаружения типичных морфологических элементов. Это затрудняет установление наличия мекония и кала в следах на вещественных доказательствах и требует разработки более эффективных способов выявления этих выделений и их дифференциальной диагностики.

При выявлении панкреатической амилазы в меконии и кале с помощью пробы в крахмально-агаровом геле получили следующие результаты. Во всех образцах кала проба была положительной спустя 3 сут, 1 и 6 мес, 1 и 2 года после забора материала. В образцах мекония мертворожденных плодов с 20-й по 34-ю неделю внутриутробного развития спустя 3 сут после забора материала проба была отрицательной, а в 47% образцов мекония плодов с 35-й по 41-ю неделю — положительной. Положительной оказалась проба при исследовании 68% образцов мекония живых новорож-денных. Такие же результаты получили спустя 1 и 6 мес, 1 и 2 года после забора материала.

Трипсин в меконии и кале методом субстратной пленки обнаружили во всех образцах кала спустя 3 сут, 1 и 6 мес, 1 и 2 года после забора материала. При исследовании образцов мекония мертворожденных плодов с 20-й по 30-ю неделю внутриутробного развития спустя 3 сут после забора материала получили отрицательные результаты; с 31-й по 34-ю неделю — в 18%, с 35-й по 41-ю неделю — в 50% образцов. Наличие трипсина установили в 60% образцов мекония живых новорожденных. Такие же результаты оказались спустя 1 и 6 мес, 1 и 2 года после забора материала.

Во всех образцах кала взрослых лиц при выявлении панкреатической амилазы и трипсина мекония и кала результаты были положительные, в то время как при исследовании образцов мекония получили как положительные, так и отрицательные результаты. Количество положительных результатов возрастало с увеличением внутриутробного возраста. Отрицательные результаты пробы с образцами мекония можно объяснить низкой секреторной активностью гландулоцитов панкреатических ацинусов плодов и новорожденных [8]. Положительные результаты с образцами кала объясняются тем, что часть ферментов, не затраченных на пищеварение в желудочно-кишечном тракте, выделяется в активной форме в составе каловых масс.

Таким образом, проба по выявлению амилазы в крахмально-агаровом геле и метод субстратной пленки по определению трипсина могут быть использованы как этап комплексной диагностики кала в следах на вещественных доказательствах. Их нельзя применять для дифференциальной диагностики мекония и кала, так как при исследовании мекония они дают положительные результаты.

Следует отметить, что пробы по выявлению амилазы и трипсина качественные и не позволяют определить количественное содержание ферментов, что ограничивает их возможности.

Для обнаружения желчных кислот в меконии и кале использовали модификацию реакции Петтенкофера [9]. Во всех образцах кала реакция была отрицательной. При исследовании образцов мекония мертворожденных плодов с 20-й по 24-ю неделю в 42% образцов реакция оказалась положительной, в 29% отрицательной и в 29% сомнительной; с 25-й по 30-ю неделю — в 54, 23 и 23% соответственно; с 31-й по 34-ю неделю — в 46, 36 и 18% и с 35-й по 41-ю неделю — в 32, 47 и 21% соответственно. Исследование образцов мекония живых новорожденных дало следующие результаты: в 52% образцов — положительные, в 28% — отрицательные и в 20% — сомнительные.

При исследовании мекония получили как положительные, так отрицательные и сомнительные результаты, которые не зависели ни от давности хранения материала, ни от внутриутробного возраста плодов и новорожденных.

Отрицательные результаты реакции с образцами кала объясняются тем, что у взрослых лиц большая часть желчных кислот (80—95%) реабсорбируется в кишечнике по системе воротной вены, а оставшаяся часть выделяется с фекалиями в виде бактериальных метаболитов [10].

Полученные результаты свидетельствуют о том, что модификация пробы Петтенкофера на наличие желчных кислот не может быть использована для дифференциальной диагностики мекония и кала, так как с образцами мекония дает не только положительные, но и отрицательные результаты.

Также следует подчеркнуть, что данная проба носит качественный и субъективный характер, так как результаты оценивают путем визуального наблюдения за изменением цвета раствора, что резко ограничивает возможности метода.

Для изучения спектров поглощения видимого и ультрафиолетового света меконием и калом применили спектрофотометрию с использованием спектрофотометра СФ-2000 со спектральным диапазоном от 190 до 1100 нм [11, 12].

Максимум поглощения света зарегистрирован при исследовании образцов кала при длине волны 498,0±2,65 нм, образцов мекония — при 332,42±2,05 и 399,84±2,6 нм [13]. Следовательно, при исследовании мекония и кала с помощью спектрофотометрии зарегистрированы характерные для каждого из этих выделений спектры поглощения видимого и ультрафиолетового света, что может быть использовано как для их обнаружения, так и для дифференциальной диагностики данных выделений.

На основе спектрофотометрии разработан способ установления наличия мекония и/или кала в следах на вещественных доказательствах [14].

Для изучения пигментного состава мекония и кала использовали метод восходящей тонкослойной хроматографии [15—18].

В ходе исследования установили, что при элюировании вытяжек из пятен кала в системе растворителей бутанол—ледяная уксусная кислота—вода в соотношении 4:1:2 на хроматографических пластинах появлялись полосы оранжевого цвета при Rf = 0,55—0,6 (отношение расстояния, пройденного исследуемым веществом, к расстоянию, пройденному растворителем), которые при нанесении реактива Эрлиха приобретали красную окраску, что свидетельствует о наличии уробилиновых тел (стеркобилина) [19].

При исследовании мекония, крови, мочи, слюны, пота, влагалищного содержимого этим же методом реакция на наличие стеркобилина была отрицательной.

Отрицательные результаты реакции с образцами мекония объясняются особенностями обмена желчных пигментов у плода и новорожденных, в связи с чем основным желчным пигментом мекония является билирубин, а не стеркобилин, который в меконии отсутствует [20—24].

Установили, что воздействие крайних температур — до 100 ˚С в течение 2 ч и –15 ˚С в течение 1 сут не влияет на выявление стеркобилина кала. Оказалось также, что процессы гниения отрицательно сказываются на обнаружении стеркобилина кала методом восходящей тонкослойной хроматографии.

На основе данного метода разработан способ установления наличия кала, основанный на выявлении желчного пигмента — стеркобилина [25]. Этот способ может быть использован как для установления наличия кала в следах на вещественных доказательствах, так и при дифференциальной диагностике кала и мекония.

Предлагаем следующий порядок выявления мекония и кала в следах на вещественных доказательствах: вырезку из пятна экстрагировать изотоническим раствором натрия хлорида в течение 24 ч при температуре 4 ˚С. После удаления предмета-носителя вытяжку центрифугировать в течение 4—5 мин при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость использовать для выявления стеркобилина методом тонкослойной хроматографии и для изучения спектров поглощения видимого и ультрафиолетового света методом спектрофотометрии. Осадок поместить на 20 ч в 10 мл 15% раствора уксусной кислоты, отмыть путем центрифугирования, перенести на предметные стекла и микроскопировать для изучения морфологического состава.

Вывод о наличии мекония в следах на вещественных доказательствах делают при обнаружении в микроскопических препаратах мекониевых телец, клеток рогового слоя эпидермиса кожи и пушковых волос, регистрации пиков поглощения света при длине волн 332,42±2,05 и 399,84±2,6 нм методом спектрофотометрии. Наличие кала подтверждает обнаружение в микроскопических препаратах волокон мышечной и соединительной тканей, элементов неперевариваемой и перевариваемой клетчатки, зерен крахмала и колоний йодофильной микрофлоры, регистрацию пика поглощения видимого света при длине волны 498,0±2,65 нм методом спектрофотометрии и/или выявление желчного пигмента стеркобилина методом восходящей тонкослойной хроматографии.

Разработаны объективные способы установления наличия мекония и кала в следах на вещественных доказательствах, а также критерии их дифференциальной диагностики, основанные на особенностях морфологического, ферментного и пигментного состава, что позволяет повысить эффективность судебно-биологических экспертиз по обнаружению этих выделений.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.