Неостигмина метилсульфат (3-[(диметилкарбамоил)окси]-N, N, N-триметиланилина метилсульфат): (торговые названия: прозерин, эустигмина метилсульфат) — синтетическое антихолинэстеразное лекарственное средство, обратимо ингибирующее холинэстеразу [1—4].

По физико-химическим свойствам представляет собой белый кристаллический порошок без запаха, горького вкуса, плавится при температуре 141—149 °C. Очень легко растворяется в воде (1:10), легко — в этаноле (1:5). Молекулярная масса 334,39 г/моль [1, 5].

УФ-спектр неостигмина метилсульфата в среде 0,1 N Н₂SO₄ имеет максимумы поглощения 260 и 266 нм, в воде — 263 нм. Спектральные отношения 220/210 и 260/210 нм в смеси буферный раствор рН 2,8 — ацетонитрил (1:1) составляют соответственно 0,43 и 0,05. ИК-спектр включает характеристические максимумы (см^–1): 3020 и 2900 (СН), 1730 (С=O), 1610 и 1595 (С=С), 1070 и 1030 (СN). В масс-спектре (метод электронного удара) присутствуют ионы 58, 64, 72 (базовый), 208 (m/z) [6—8].

При ВЭЖХ в колонке сорбента ProntoSIL-120−5-C18AQ размером 0,2×75 мм элюенты, А – [4М LiClO₄ – 0, l М НСlO₄] — Н₂О (5:95), Б — ацетонитрил; режим элюирования — линейный градиент от 5 до 100% А за 40 мин, затем 100% А в течение 3 мин, скорость потока 100 мкл/мин, температура колонки 40 °C, УФ-детектирование при длине волны 210 нм, время удерживания аналита 10,06 мин, ширина пика на половине высоты 0,113 (мин), асимметрия пика 1,16 [9].

Неостигмин, как и близкие к нему структуры, токсичен для теплокровных [10, 11]: LD₅₀ неостигмина составляет при пероральном введении крысам 7,5—14,4 мг/кг, при внутривенном 0,315 мг/кг, при подкожном 0,445мг/кг, при внутримышечном 0,423 мг/кг; при внутривенном введении кошкам 0,25—0,40 мг/кг; при внутрижелудочном введении мышам 7,5 мг/кг [1, 12].

При попадании в значительных количествах в организм человека неостигмин способен вызывать тяжелые отравления с потенциальной угрозой летального исхода.

Описаны многочисленные отравления неостигмином с летальным исходом в сочетании с атропином, в том числе внезапная остановка сердца [10, 13—16].

В литературе [17] приведен случай отравления прозерином при его ошибочном внутривенном введении пациентке вместе с глюкозой вместо раствора соли тиамина.

Сообщается о 2 случаях некардиогенного отека легких (NCPE) как фатального осложнения в результате введения неостигмина в сочетании с гликопирролатом при оперативном вмешательстве под общей анестезией [18].

На основе анализа случаев смертельных отравлений неостигмином определена его минимальная смертельная доза для человека: при подкожном введении 1,4—10 мг, при приеме внутрь 4,2—60 мг [16].

Неостигмин метаболизируется в организме предположительно в печени с образованием преимущественно 3-гидроксифенилтриметиламмония, 3-гидроксифенилдиметиламмония и их глюкуронидов [19—21].

При внутримышечном введении крысам несмертельных доз неостигмина и 3-гидроксифенилтриметиламмония неостигмин метаболизируется до 3-гидроксифенилтриметиламмония и его глюкуронида; 3-гидроксифенилтриметиламмоний превращается в глюкуронид. Из организма неостигмин выделяется в неизменном виде, в виде 3-гидроксифенилтриметиламмония и его глюкуронида, а 3-гидроксифенилтриметиламмоний — в неизменном виде и в виде глюкуронида [22].

Для изолирования неостигмина из биоматриц обычно используют водные растворы, подкисленные щавелевой или хлороводородной кислотой, либо подкисленный этанол [8, 10]; для очистки применяют жидкостную, в том числе ионопарную экстракцию [23—25], сорбцию на силикагелях [8, 26, 27] и катионообменниках [28].

Часть этих методик характеризуется длительной и трудоемкой пробоподготовкой, другие (рассчитанные на анализ биожидкостей) не могут быть рекомендованы для исследования тканей органов и их содержимого без дополнительных корректировок.

Известны способы разделения и идентификации неостигмина и его метаболитов с помощью электрофореза на бумаге, ионообменной и бумажной хроматографии [20, 22].

Неостигмин может быть определен также по степени ингибирования им иммобилизованной ацетилхолинэстеразы с помощью спектрофотометрического детектирования [29].

Для определения неостигмина и близких структур в биоматрицах описаны фотометрические методики по образованию комплексов и ионных ассоциатов с сульфофталеиновыми [7, 23, 28] и моноазокрасителями [30], а также на основе получения азокрасителей [31].

Данные методики относительно сложны, длительны и часто отличаются узким диапазоном линейности.

Известна методика потенциометрического определения неостигмина бромида в моче человека на основе образования ионно-парных ассоциатов при использовании 4 типов датчиков с покрытием из серебра, меди, графита и стеклообразного углерода [32].

Для определения рассматриваемого соединения в биоматериале используют ГЖХ и ВЭЖХ. Так, описано обнаружение неостигмина в крови и моче с помощью ГЖХ после предварительного термического деметилирования аналита в испарителе с использованием набивных колонок (неподвижные фазы SE-30 и OV-17 на хроматоне) и термоионного детектирования [27].

Известна методика оценки содержания неостигмина и его основного метаболита в плазме и моче больных миастенией на основе ионно-парной экстракции аналитов из биоматриц дихлорметаном или смесью дихлорметан-ацетон и последующей газожидкостной хроматографии [25].

Описан вариант определения неостигмина в плазме крови больных миастенией методом ГХ-МС с использованием химической ионизации [33].

B. Zhao и соавт. [34] провели различные способы обнаружения неостигмина бромида в биологических образцах с помощью ГЖХ и ВЭЖХ.

Разработан вариант выявления неостигмина методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ-детектированием при длине волны 214 нм после ионно-парной экстракции аналита из биологических жидкостей [35].

Предложены способы определения содержания неостигмина метилсульфата в биожидкостях методом ВЭЖХ в колонках обращенно-фазового сорбента (С-8 и С-18) при элюировании смесями раствора калия дигидрофосфата или фосфорной кислоты с ацетонитрилом или метанолом (содержание модификатора 10—13%) и УФ-детектировании при длине волны 260 нм [24, 36].

Метод ВЭЖХ применяли для определения неостигмина в плазме людей-добровольцев при исследовании влияния гипотермии на эффективность и фармакокинетику данного соединения [37].

При выявлении неостигмина в плазме крови крыс после его трансдермальной электропорации применяли ВЭЖХ с диодно-матричным детектированием: колонка PhenoSphere SCX (5 мкм, 150×4,6 мм), подвижная фаза — (0,5 М раствор NaH₂PO₄ (pH 3,5) — ацетонитрил (45:55 по объему), аналитическая длина волны 200 нм [38].

Для определения неостигмина в плазме крови собак предложено сочетание ВЭЖХ и тандемной масс-спектрометрии с использованием колонки Hanbon Hedera CN и подвижной фазы метанол-вода (60:40 по объему) с содержанием в воде 0,01% муравьиной кислоты [39].

Известен вариант определения неостигмина в воздухе рабочей зоны методом ВЭЖХ с использованием сорбента Сепарон С18 (колонка 75×2 мм), подвижной фазы ацетонитрил — 0,02 М калия дигидрофосфата pH 3,0 (1:1 по объему) и УФ-детектирования при длине волны 220 нм [40].

Как видно, ВЭЖХ с УФ-детектированием применяется в исследованиях извлечений из жидких биоматриц. Использование метода при работе с извлечениями из органов затруднительно из-за влияния фонового поглощения эндогенных веществ. Варианты ГЖХ сложны вследствие необходимости предварительной дериватизации и трудоемкой пробоподготовки.

В описании экспертиз случаев отравления неостигмином не указываются органы или биожидкости, наиболее целесообразные для определения в них отравляющего вещества [10, 16, 17, 41].

При экспертизе случаев летального отравления прозерином и сочетанного летального отравления мапротилином и неостигмином изолирование неостигмина из трупного материала проводили подкисленной водой, выделение из кисловодного извлечения — раствором йода в хлороформе, идентификацию и количественное определение — методами бумажной хроматографии и экстракционной фотометрии, при этом неостигмин удавалось найти в желудке с содержимым и печени [10, 41].

Изучение распределения 3-гидроксифенилтриметиламмония (метаболит неостигмина), введенного внутримышечно крысам в несмертельных дозах, показало, что вещество присутствует преимущественно в печени, почках и сердце подопытных животных [22].

Имеются данные о распределении неостигмина при внутрижелудочном введении его кроликам в дозе 7,5 мг/кг, не приводящей к гибели животных (их умерщвляли созданием искусственной эмболии) [23].

Вследствие отсутствия самостоятельной гибели животных и отличий токсикодинамики у травоядных и человека не вполне корректно переносить данную модель распределения неостигмина при внутрижелудочном введении на организм человека. Более близкими к человеку, чем травоядные, по характеру распределения отравляющих веществ считаются всеядные теплокровные, например крысы или мыши.

Цель исследования — выявление особенностей распределения неостигмина метилсульфата в организме всеядных теплокровных (крысы) после внутрижелудочного введения заведомо летальной дозы данного вещества.

Исследовали субстанцию неостигмина метилсульфата (ФС 42−3001−93), содержащую не менее 97% действующего соединения. Исследование проводили на крысах-самцах породы Wistar 6-месячного возраста с массой тела от 395 до 425 г в условиях острого эксперимента. За 1 сут до начала эксперимента животных лишали пищи, оставляя доступ к воде. Неостигмина метилсульфат вводили в организм животных 5 опытных групп (по 5 особей в каждой) внутрижелудочно через специальный зонд в виде 1% водного раствора однократно в количестве 30 мг (≈ЛД₅₀×3).

Выбор летальных концентраций неостигмина обусловлен тем, что в практике судебно-химического анализа, как правило, исследуют трупный материал, взятый от значительно большего, чем летальная доза, количества отравляющего вещества.

Трупы погибших от отравления животных вскрывали, одноименные органы извлекали, объединяли, измельчали до частиц размером 0,2—0,4 см и исследовали на наличие в них неостигмина. Параллельно исследовали органы животных контрольной группы (5 особей), которым предварительно вводили в желудок только дистиллированную воду.

Скрининговую методику, обычно используемую при проведении судебно-химических экспертиз и основанную на изолировании с последующей экстракцией в органическую фазу из кисловодной, а затем из водно-щелочной среды, не применяли. Это объясняется тем, что в данном случае подобным образом не удавалось определить неостигмин, который терялся на стадии экстракции из-за очень низких значений коэффициента распределения.

Для выявления неостигмина в органах и крови отравленных животных нами предложены и валидированы частные методики исследования.

Изолирование. В оптимальном режиме изолирование осуществляли путем настаивания в течение 45 мин мелкоизмельченной ткани органов ацетоном при периодическом помешивании. Экстрагирование повторяли 2 раза, вытяжки сливали, объединяли и центрифугировали. Объединенный экстракт выпаривали досуха на водяной бане [8].

Сухой остаток растворяли в 4 мл ацетона (раствор для исследования).

Идентификация методом ТСХ. На линии старта двух хроматографических пластин (№ 1 и № 2) типа Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ, предварительно обработанных раствором вазелинового масла в гексане (для создания модели динамической обращенной фазы С₁₄—С₁₅), наносили по 0,6 мл раствора для исследования и хроматографировали, используя подвижную фазу буферный раствор pH 1,98 — ацетон в соотношении 8:2 в присутствии вещества-свидетеля.

Идентификация методом ВЭЖХ. После идентификации методом ТСХ из хроматограммы (пластина № 1) вырезали участок с пятном исследуемого вещества, помещали его в пробирку и элюировали неостигмин из слоя сорбента этанолом (настаивание в течение 15 мин при периодическом помешивании). Этанольный элюат отделяли, элюент испаряли в токе воздуха при комнатной температуре до получения сухого остатка.

Остаток растворяли в 4 мл смеси ацетонитрил — 0,02 М раствор калия дигидрофосфата (1:1), затем 16 мкл полученного раствора вводили в жидкостный микроколоночный хроматограф типа Милихром со спектрофотометрическим детектором. Хроматографировали в стальной колонке КАХ-44−3 (50×2 мм), заполненной сорбентом Сепарон С-18 (основной размер частиц 5 мкм). Элюировали системой растворителей ацетонитрил — 0,02 М раствор калия дигидрофосфата рН 3,0 (1:1), подавая подвижную фазу со скоростью 100 мкл/мин. Сигнал регистрировали при длине волны 220 нм [40]. Анализируемое соединение идентифицировали по характерному для него времени удерживания (t_R).

Идентификация по УФ-спектру и количественное определение. После идентификации методом ТСХ из хроматограммы (пластина № 2) вырезали участок с пятном исследуемого вещества, помещали его в пробирку и элюировали неостигмин из слоя сорбента этанолом (настаивание с 5 мл растворителя в течение 15 мин при периодическом помешивании). Оптическую плотность элюата измеряли на спектрофотометре СФ-56 в кюветах кварцевого стекла с толщиной рабочего слоя 10 мм при длине волны в интервале 200—350 нм. При высоких значениях оптической плотности элюат разбавляли.

Проводили валидацию методик определения содержания неостигмина в твердых матрицах и крови на основе УФ-спектрофотометрии по показателям линейности, селективности, правильности, прецизионности, пределам обнаружения и количественного определения в соответствии с правилами, принятыми для биоаналитических методик [42, 43].

Извлечения из тканей внутренних органов трупов крыс, не получавших неостигмина метилсульфат (контрольная группа), исследовали по аналогичной схеме, что и извлечения из внутренних органов отравленных животных.

При проведении идентификации методом ТСХ хроматограммы проявляли в УФ-свете (длина волны генерируемого излучения 254 нм). Неостигмин при этом обнаруживали по наличию темного пятна на более светлом базовом фоне пластин в УФ-свете. Значение абсолютной хроматографической подвижности аналита при этом составляло 0,34±0,02.

Хроматографирование в колонке обращенно-фазового сорбента методом ВЭЖХ в заданных условиях проведения исследования показало, что время удерживания (t_R) аналита, извлеченного из различных биологических матриц, составляло 140±9.

Спектральные кривые неостигмина, полученные после изолирования вещества из биологических объектов, имели такие же форму и положение точек экстремумов, как и спектральная кривая чистого вещества в этаноле (220±4 и 265 ± 2 нм) (см. рисунок).

В результате валидации по показателю линейности установили, что уравнения линейной зависимости для методик определения неостигмина в твердых матрицах и крови имеют вид: А = 0,209989·С+0,009249 (коэффициент корреляции 0,99864) и 0,235941∙С+0,011684 (коэффициент корреляции 0,99892), где, А — оптическая плотность; C — массовое содержание определяемого вещества в биоматрице в миллиграммах в 1 г (мг/г). Обе методики приемлемы по критерию линейности, так как коэффициенты корреляции превышают 0,995. Линейные участки обоих графиков соответствуют интервалам концентраций 0,1—6,0 мг/г (в твердых биоматрицах) и 0,08—6 мг/г (в крови). Отклонения концентраций градуировочных смесей, найденных с применением уравнений линейной зависимости от истинных значений, представлены в табл. 1.

Как видно из данных табл. 1, отклонения укладываются в допустимые пределы (не более ±20% для наименьшей градуировочной концентрации и не более ±15% для остальных концентраций).

Результаты определения правильности и прецизионности отражены в табл. 2 и 3.

Таким образом, методики удовлетворяют критериям правильности — относительная (к введенному количеству аналита) погрешность не превышает ±20%, и прецизионности — относительное стандартное отклонение S_r< 0%.

Доказана селективность предложенной методики, так как в УФ-спектре, полученном по результатам контрольного опыта, отсутствуют выраженные полосы поглощения и заметные сдвиги спектральной кривой в области аналитического максимума (265 нм).

Для методик определения содержания неостигмина в твердых матрицах и крови значения предела обнаружения (ПО) равны соответственно 0,08 и 0,06 мг/г, а предела количественного определения (ПКО) — 0,1 и 0,08 мг/г.

Исследование извлечений из тканей органов, содержимого желудка и тонкой кишки, а также крови крыс контрольной группы показало отсутствие в данных объектах неостигмина или близких по структуре веществ. Фоновое поглощение элюатов из участков контрольных хроматограмм в пересчете на извлечение из 5 г одинаковых органов животных при измерениях в области максимумов длины волны 220 и 265 нм не превышало соответственно 0,080 и 0,016 ед. оптической плотности.

Количество анализируемого вещества определяли по величине экстинкции этанольного элюата, измеренной в области максимума длинноволновой полосы поглощения (265 нм).

Результаты определения содержания неостигмина в различных органах, крови и содержимом желудка отравленных животных, исследованных после их гибели от введения тройной LD₅₀ отравляющего агента в желудок, отражены в табл. 4.

Наиболее значительные количества неостигмина в 1 г биоматериала присутствуют в сердце (365,2±33,94 мкг), селезенке (288,6±24,97 мкг), почках (127,6±9,33 мкг) и стенке желудка (124,6±12,17 мкг) отравленных животных. В несколько меньших количествах аналит определяется в легких, тонкой кишке с содержимым и содержимом желудка.

1. Проведено исследование характера распределения неостигмина метилсульфата в организме всеядных теплокровных (крысы), отравленных тройной LD₅₀ путем одноразового введения вещества в желудок.

2. Установлено, что максимальное количество неостигмина обнаруживается в сердце, селезенке, почках и стенке желудка животных (крысы), отравленных данным соединением.

3. Методики определения неостигмина в биоматрицах валидированы по критериям линейности, селективности, правильности, прецизионности, пределам обнаружения и количественного определения и могут быть применены в экспертной практике при направленном химико-токсикологическом анализе.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

¹e-mail: pharmchem.vgma@mail.ru; https://orcid.org/<br />0000-0001-8946-9718;

²e-mail: R-WLADIMIR@yandex.ru; https://orcid.org/<br />0000-0001-8872-0691